JBRA Assist. Reprod. 1998;02(01):11-15
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1998.2.1.03
Inyeccion intracitoplasmatica de espermatozoides (ICSI) en el tratamiento de la azoospermia obstructivay secretora
Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in obstructive and non obstructive azoospermia
Resumen
La utilizatión de la técnica de ICSI permite el logro del embarazo en parejas con severos problemas seminales inclusive en casos de azoospermia tanto obstructiva como secretora. Desde la introducción del ICSI en Argentina en 1994 se han realizado en CEGyR más de 600 ciclos de ICSI. El propósito del presente trabajo es el de evaluar los resultados de ICSI en 70 ciclos de azoospermia.
Material y Métodos: Entre el 15 de noviembre de 1994 y el 31 de julio de 1997 se realizaron en CEGyR 507 ciclos de ICSI. Los pacientes con azoospermia obstructiva fueron 19 y realizaron 44 ciclos de ICSI, los pacientes con azoospermia secretora fueron 44 e iniciaron 46 ciclos de ICSI.
Resutados: Azoospermia obstructiva : En 10 casos la obtentión de espermatozoides se realizó per punción de epididimo, en 13 por biopsia testicular y en un caso se utilizó muestra previamente criopreservada. El porcentaje de fertilizatión normal fue de 94,37 %. En un caso no hubo fertilizatión realizándose 23 transferencias. La tasa de embarazo por transferencia fue del 39,13 % y la de implantatión del 14,94%. Azoospermia secretora: Se iniciaron 46 ciclos con 44 pacientes. En 19 casos no se hallaron espermatozoides en la biopsia (43,18%). Los esperrmatozoides se obtuvieron por biopsia testicular salvo en un caso que se usó muestra previamente criopreservada. El porcentaje de fertilizatión normal fue del 94,36 %. Se realizaron 27 transferencias. La tasa de embarazo por transferencia fue del 40,74 % y la de implantatión del 16,09%.
Conclusión: Los resultados obtenidos en CEGyR indican que la asociación de ICSI con aspiratión de espermatozóides en casos de azoospermia es una excelente alternativa para estos pacientes. En casos de azoospermia secretora la posibilidad de encontrar espermatozoides en la biopsia es el 63,82 %, siendo las oportunidades de fertilizatión normal y embarazo similares a las de los pacientes con azoospennia obstructiva.
Palabras clave: azoospermia, ICSI, espermatozoide
Abstract
Since the advent of ICSI the couples with severe male factor have the oportunity of achieving pregnancy by using this assisted reproduction technique including obstructive and non obstuctive azoospermic patients. In Argentina the ICSI technique has been used since 1994. More than 600 cycles of ICSI have been done in CEGyR. The purpose of this article is to show CEGyR's experience with ICSI in 70 cases of obstructive and non obstructive azoospermia.
Material and Methods: Since the period november 1994 until july 1997, 507 cycles of ICSI have been done in CEGyR. There were 19 obstructive azoospermic patients and 24 cycles of ICSI were done. Forty four non obstructive patients began 46 cycles of treatment.
Results: Obstructive azoospermia: Ten patients obtained spermatozoa from epididymo, 13 from the testis and 1 patient used previously criopreserved sample. The normal fertilization rate was 94,37%. There was no fertilization in one case, therefore 23 transfers were done. The pregnancy rate was 39,13 % and the implantation rate was 14,94%. Non obstructive azoospermia: Forty six cycles of ICSI were initiated with 44 patients. Spermatozoa were retrieved from the testis. In 19 patients there were no spermatozoa in the testicular biopsy (43,18%). In one case previously cryopreserved sample was used. The normal fertilization rate was 94,3 %. Twenty seven transfers were done. The pregnancy rate was 40,74 % and the implantation rate was 16,09 %.
Conclusion: Results obtained in CEGyR shows that the association of ICSI with sperm aspiration in azoospermic patients is a good choice for them. In non obstructive azoospermia spermatozoa were obtained from the testis in 63,82%. Chances of normal fertilization and pregnancy rate as well as implantation rate are similar in obstructive and non obstructive azoospermic patients.
Keywords: azoospermia, ICSI, spermatozoa
Introducción
La falta de espermatozoides en el eyaculado (azoospemia) puede ser de causa obstructiva o secretora. La azoospermia obstructiva, debida a una ausencia congénita de deferentes o secundaria a una obstrucción de la vía (generalmente causas infecciosas), o por desembocadura anómala de los conductos eyaculadores en el utrículo prostático, o a una reconstrucción quirúrgica fallida de una obstrucción, era hasta hace pocos años una causa de esterilidad sin tratamiento posible. La utilización de fertilización "in vitro" con espermatozoides recuperados de epididimo (Pryor et al., 1984) permitió el logro de embarazos en estas parejas aunque con pobres resultados. Los casos de azoospermias no obstructivas no podian ser tratados con esta técnica ante la ausencia de espermatozoides epididimarios.
Con el advenimiento del ICSI (Palermo et al., 1992) las parejas con problemas de azoospermia encontraron una solución ante la posibilidad de lograr la formación del embrión con espermatozoides obtenidos tanto del epididimo (Craft et al., 1995) en las azoospermias obstructivas como del testículo (Craft et al., 1993) (Silber et al., 1995) en ambos tipos de azoospermias.
Desde la introducción del ICSI en nuestro pais en 1994 hemos realizado en el CEGyR más de 600 ciclos de ICSI hasta la fecha; el propósito de este trabajo es el de presenter la experiencia del CEGyR con la técnica de ICSI en pacientes con diagnóstico de azoospermia.
Material y Metodos
Población
Durante el período comprendido entre el 15 de noviembre de 1994 y el 31 de julio de 1997 se realizaron en CEGYR 507 ciclos de ICSI, de los cuales 70 (13,8%) correspondieron a pacientes con azoospermia.
Los pacientes que presentaron azoospermia obstructiva fueron 19 (correspondiendo a 24 ciclos de tratamiento). La edad promedio de las mujeres fue de 30,7 años y la de los varones de 31,5 años. El dosaje promedio de FSH de estos pacientes fue de 4,66±2,19.
Se iniciaron 46 ciclos de ICSI en casos de azoospermia secretora que correspondieron a 44 pacientes cuya edad promedio fue de 35,7 años y la de las mujeres fue de 29,6 años. El valor promedio de FSH de los varones resultó ser de 11±1,2.La estimulación de ovulación se realizó según cada caso en particular con análogos de GnRH (Lupron 2,8 ml - Lupron Depot 3,75mg, Laboratorios Abbott) comenzando en el dia 21 del ciclo, FSH pura 150 U.I. (Metrodine H.P. 150 U.I., Laboratorios Serono) o recombinante (Gonal F 150 U.I., Laboratorios Serono) junto con hMG 150 U.I. (Pergonal-1000, Laboratorios Serono). La recuperación ovocitaria se Ilevó a cabo bajo anestesia local o general por via transvaginal a las 35 hs. de la aplicación de una única dosis de 10.000 U.I. de hCG.
Procedimíentos para la obtención de espermatozoides
A - Punción aspiración de epididimo - descripción de la técnica:
Luego de la preparación del campo operatorio se procede a realizar la anestesia local del cordon espermático. Se identifica palpatoriamente el epididimo y se procede a su punción con aguja 27 G y jeringa de 1cc la cual contiene medio HTF (Human Tubal Fluid modificado con buffer Heppes) suplementado con albúmina bovina aproximadamente 100 ul. Se aspira en forma sostenida y se envia al laboratorio tal cual es extraída. Se realizan varias punciones con diferentes agujas hasta que se confirma la presencia de espermatozoides.
A1- Procesamiento de los espermatozoides en el laboratorio:
Una vez recibidas las jeringas las mismas son purgadas con medio. Se lava con 3ml de HTF suplementado durante 5 minutos a 300 g. Se descarta el sobrenadante y se resuspende el pellet en 100 ml de medio. Se toma una muestra para evaluar y se coloca en estufa hasta el momento de la microinyección de ovocitos.
B- Biopsia testicular-técnica:
Este procedimiento puede realizarse con anestesia general o local. Luego de preparado el campo operatorio, en el caso de anestesia local, se realiza un habón de anestesia a nivel escrotal. Se incide en forma transversal tratando de seguir lineas de pliegues y se abren túnicas escrotales. Se identifica el cordón espermático el cual se infiltra con anestesia. Posteriormente se exteriorize el testiculo. Se incide con punta de bisturi en varios sitios (aproximadamente 7 ú 8) lo que permite la protrusion de la masa testicular a la presión, la cual se secciona con tijera de disección pequeña. El material obtenido se lava con solución fisiológica y se coloca en medio de cultivo para ser enviado al laboratorio. Se cierra la única albuginea testicular y escroto en dos planos con material reabsorbible.
B1 - Procesamiento de espermatozoides en el laboratorio:
La muestra es colocada en placa de Petri con 2ml de medio HTF suplementado con albúmina bovina y se dislacera con ayuda de dos portaobjetos estériles para liberar los espermatozoides de los tubos seminiferos al medio de cultivo. Luego los espermatozoides son tornados por micropipetas para su microinyección.
Criopreservación de espermatozoides
Aquellos pacientes azoospérmicos obstructives en los que la muestra obtenida en la punción o biopsia resultó suficiente pueden congelar el excedente de la muestra no utilizada para un intento posterior evitando de esta manera una nueva aspiración testicular o epididimaria. En el caso de tratarse de un paciente azoospérmico secretor el material criopreservado proviene de una biopsia testicular realizada previo al cicio de tratamiento.
Procesada la muestra se centrifuga el preparado 5 minutos a 300 g y se descarta el sobrenadante. Se añade a lo anterior 1ml del crioprotector (Egg Yolk Buffer-Irvine). Se homogeiniza la muestra, se toma una pieza de hielo seco y en su superficie se practican unos orifícios de 50 ul aproximadamente. Se carga la muestra en una pipeta y se rellenan las hendiduras del hielo. Luego de unos segundos se congela y se colocan las perlas resultantes de congelar el material en tubos Nunc que se sumergen en nitrógeno liquido hasta su utilización. El dia que se necesita la muestra las perlas son extraídas del nitrógeno liquido y se dejan a temperatura ambiente de 10 a 15 minutes. Una vez descongelada la muestra es procesada en forma similar que en el caso de la punción epididimaria.
Preparatión de ovocitos
Los ovocitos se lavan con hialuronidasa durante 30 segundos (80 UI por cc de HTF). De esta manera se los libera del cúmulus ooforus y de la corona radiada. El lavado se realiza con pipetas ultrafinas y delicadamente. A continuación se los lava en diferentes gotas de medio de cultivo para asegurarse de que no queden rastros de la hialuronidasa y se los observa en microscopio invertido mientras se realiza el diagnóstico de maduración nuclear.
Microinyección:
Solamente se inyectan ovocitos metafase II. Los mismos se colocan en gotas de 5 ul de H-HTE y se incuban 4 horas antes de poder ser utilizados. Se preparan una o dos gotas de 5 ul de PVP (Polivinil pirrolidona) para purgar las pipetas y gotas de 4ul de PVP a las cuales se les agrega 1 ul de semen para enlentecer los movimientos de los espermatozoides y asi favorecer el manejo de los mismos en la pipeta de inyección. Todas las gotas son cubiertas con aceite mineral liviano (Sigma). El aceite es lavado con solución de Dulbeco el dia anterior y equilibrado toda la noche previa en estufa y filtrado en por de 0,8 um.Luego de ser inyectados, los ovocitos son colocados en cápsulas de cultivo que contienen microgotas de HTF suplementado con suero sintético de Irvine (SSS) cubiertos con aceite mineral.
Fertilización- Calidad embrionaria- Transferencia-Fase lútea:
Entre las 12 y 18 horas posteriores a la microinyección se observa la presencia de pronúcleos para diagnóstico de fertilización, verificando entre 45 a 48 horas post-punción el estadio y calidad embrionaria.
La transferencia uterina de embriones se realiza entre las 48 a 72 horas de la microinyección usando canula de Frydman (Prodimed- France). La fase lútea se suplementa con 800 mg por dia de progesterona micronizada intravaginal (Utrogestan, Rontag) comenzando el dia previo a la transferencia hasta conocer el resultado del test de embarazo, el cual se solicita a los 12 dias de la transferencia. Si el test resulta positivo se solicita curva de ß-hCG y ecografía transvaginal a las 2 semanas del primer test positivo para evaluar la presencia de gestación intrauterine, número de sacos y actividad cardíaca. De resultar normal se continúa con la administración de progesterona hasta la semana 12 a 14 momento en el cual es suspendida.
Se considera como embarazo clinico a aquél que presenta saco gestacional al momento de realizar la primera ecografia transvaginal a la cuarta semana de la transferencia.
Se define como tasa de implantatión a la relatión existente entre el número de embriones transferidos y el número de sacos gestacionales observados por ultrasonido.
Resultados
Azoospemias obstructivas:
En 19 pacientes que presentaron azoospermia obstructiva se realizaron 24 ciclos de ICSI. Se aspiraron un total de 329 ovocitos, resultando un promedio de 13,7 ovocitos por ciclo. La obtentión de espermatozoides se realizó en 10 ciclos por punción aspiratión de epididimo. En 13 ciclos los espermatozoides se recuperaron por biopsia de testículo, procedimiento empleado originariamente en CEGyR hasta el perfeccionamiento de la punción, o bien porque la misma resultó negativa. Una pareja realizó ICSI con muestra previamente criopreservada. Se inyectaron 214 ovocitos de los cuales fertilizaron 142 (66,35%), de los cuales 134 fertilizaron normalmente (94,37%) (Tabla I).
Tabla I.
Se realizaron 23 transferencias embrionarias ya que en un caso (punción de epididimo) no se logró fertilización. El total de embriones transferidos fue de 87 ya que el resto de los ovocitos pronucleados fueron criopreservados o no clivaron. Se transfirieron 61 embriones clase III-IV (70,1%) y 26 clase I-II (29,90%). Se obtuvieron 9 embarazos (5 en casos de biopsia de testículo, 3 con punción de epididimo y 1 con muestra congelada), 7 de los cuales fueron simples y 2 triples. La tasa de embarazo por transferencia fue de 39,13% y la de implantación de 14,94% (Tabla II). Se produjeron 2 abortos, uno en el caso del embarazo obtenido con muestra congelada y el otro fue el aborto de uno de los embriones de un embarazo triple. El otro embarazo triple resultó en un recién nacido sano, un recién nacido que presentó torción testicular intrauterina y un polimalformado que murió intraútero.
Tabla II.
Azoospermias secretoras:
Se levaron a cabo 46 titios de tratamiento en 44 pacientes. En 19 casos no se hallaron espermatozoides en la biopsia (43,18%). El dosaje promedio de FSH fue similar en aquellos pacientes que presentaron espermatozoides en la biopsia (10,86 mUl / ml) y en los pacientes en los que no se recuperaron espermatozoides (12,57 mUl /ml). El total de ovocitos recuperados fue de 280, a razón de 10,37 por ciclo. En 26 casos los espermatozoides se obtuvieron por biopsia de testiculo y en un caso la muestra utilizada provino de testiculo criopreservado. Se inyectaron 198 ovocitos fertilizando 114 (57,57%) siendo el porcentaje de fertilización normal del 94,36% (Tabla III).
Tabla III.
Se realizaron 27 transferencias . El total de embriones transferidos fue de 87 ya que el resto de los ovocitos pronucleados fueron criopreservados o no clivaron. Se transfirieron 69 embriones clase III-IV (79,3%) y 18 clase III (20,7%). Se obtuvieron 11 embarazos, 8 únicos y 3 dobles. La tasa de embarazo por transferencia resultó ser del 40,74 % y la de implantación del 16,09% (Tabla IV), Se reportan 3 abortos, los tres en casos de embarazos únicos. En un caso de embarazo simple se obtuvo un mortinato a término con malformación cardiaca.
Tabla IV.
En la Tabla V se comparan los resultados obtenidos en ambos grupos de pacientes no habiéndose constatado diferencia entre ambos en lo que respecta a tasa de fertilización, tasa de embarazo y tasa de implantación.
Tabla V.
Discusión
El diagnóstico de azoospermia implica la necesidad de combinar el ICSI con una técnica de obtención de espermatozoides ya sea del testículo en casos de azoospermia secretora, o del testículo o epididimo en casos de azoospermia obstructiva.
En nuestra experiencia hemos encontrado espermatozoides en el 63,82% de las biopsias testiculares de pacientes con azoospermia secretora. Esta cifra coincide con otras similares reportadas en la literatura (Devroey et al, 1995).
Una vez obtenidos los espermatozoides parece ser de poca importancia si los mismos fueron recuperados del epididimo o del testículo, asi como si la causa de azoospermia fue secretora u obstructiva ya que la tasa de fertilización fue similar en los dos grupos. La tasa de implantación obtenida fue excelente lo cual corrobora la poca importancia del origen del espermatozoide que da origen al embrión.
Un tema digno de mención es el relacionado a la genética de aquellos varones que son infértiles. Muchos factores tienen influencia en la espermatogénesis. Varias lineas de investigación se desarrollaron para determinar la etiologia cromosómica de la infertilidad masculina. No caben dudas de que las alteraciones genéticas y génicas hacen necesario el estudio de los varones infértiles severos ya sea mediante la solicitud de estudios hemáticos (cariotipo, microdeleciones del Y, mutaciones de FQ) o la realización de técnicas en espermatozoides tales como FISH (técnica de hibridización in situ con fluorescencia) para el diagnóstico de aneuploidia. Estos estudios se realizan y solicitan en CEGyR según los antecedentes del paciente. Adernás debido al patrón heterogéneo en la herencia de ciertas patologias se aconseja asesoramiento genético de la pareja.
Con respecto al seguimiento de los niños nacidos de ICSI se ha publicado (Bonduelle et al., 1996) una frecuencia de malformaciones mayores y menores dentro del rango esperado para la población general. Sin embargo algunos grupos (In't Veld et al., 1995) (Van Steirteghem et al., 1996) informan una mayor frecuencia de alteraciones de los cromosomas sexuales en la descendencia. El seguimiento neonatal de los recién nacidos de ICSI en CEGyR demostró una incidencia del 16,4% de anormalidades cromosómicas, malformaciones menores (6,4%) y malformaciones mayores (10%), datos éstos más altos que aquellos reportados per otros autores, lo cual podria deberse, entre otros, a diferentes criterios en la categorización de malformaciones, factores ambientales, etc. (Brugo Olmedo et al., 1997). De todas formas se sugiere que el seguimiento de los niños nacidos de ICSI debe ser cuidadosamente controlado.
No caben dudas de que el ICSI brinda respuesta a aquellas parejas a quienes les resultaba prácticamente imposible la paternidad genética. El perfeccionamiento de la técnica y su combinación con procedimientos para obtener espermatozoides en los casos de azoospermia presenta buenos resultados. Sin embargo la presencia de diferentes alteraciones masculinas cromosómicas o génicas ya mencionadas, hacen necesario solicitar a las parejas los estudios previos según el caso y sugerir el asesoramiento genético pertinente a fin de conocer cuales son los riesgos potenciales para su descendencia, asi como también se impone el seguimiento estricto de los recién nacidos por esta técnica.
En conclusion los resultados obtenidos en nuestra institución nos indican que la asociación de ICSI con aspiración de espermatozoides en casos de azoospermia es una excelente alternativa para estos pacientes. En los casos de azoospermia secretora la posibilidad de encontrar espermatozoides en la biopsia es del 63,82% y en caso de darse esta situación las oportunidades de fertilización normal y de embarazo son similares a las de los pacientes con azoospermia obstructiva.