JBRA Assist. Reprod. 1998;02(01):38-44
ARTIGO DE REVISÃO
doi: 10.5935/1518-0557.1998.2.1.09
Resumo
Estudos recentes demonstraram a viabilidade do transplante de espermatogônias tronco interespecífico, intra-especifico e a partir de células criopreservadas. Esta metodologia abre novas fronteiras na área de reprodução e biotecnologia. Especificamente para o homem, determinados tipos de infertilidade podem agora ser solucionados. No entanto, apesar das perspectivas serem excelentes, muitos aspectos importantes desta fascinante abordagem devem ser ainda estabelecidos para que a mesma tenha pleno êxito.
Unitermos: testículo, transplante, espermatogônias, células tronco
Abstract
Recent studies have shown that syngenic, xenogenic and spermatogonial transplants from cryopreserved stem cells are now possible. These novel techniques open new frontiers in reproductive biology and biotechnology. Specifically for men, the potential for treatment for certain types of infertility may now be possible. However, to prove useful as a tool for biomedical science and biotechnology, many important aspects of this fascinating approach remain to be better established.
Keywords: testis, transplant, spermatogonia, stem cells
A utilização de transplantes em medicina reprodutiva tem sido tentada, sem sucesso, por muito tempo (Nugent et al., 1997). Apenas recentemente, com os avanços em diversas áreas, tais como biologia celular, genética molecular, imunologia e técnicas de criopreservação celular, foi possível retomar esta fascinante abordagem experimental (Brinster & Avarbock, 1994; Brinster & Zimmermann, 1994).
O corpo dos mamíferos possui muitos sistemas autorenováveis presentes na epiderme, epitélio intestinal, tecido hemocitopoiético e no testículo. Cada um destes sistemas é caracterizado por uma pequena população de células tronco às quais se autorenovam e, simultaneamente, produzem células que sofrem diferenciação. No entanto, é nos testículos que se localiza o único tipo celular autorenovável no indivíduo adulto capaz de contribuir para a formação de novas gerações de indivíduos (França et al., 1998). Este tipo celular é também o que gera células às quais passam por maior número de divisões durante a diferenciação celular.
Nos indivíduos sexualmente maduros, a diferenciação das células germinativas ocorre nos túbulos seminíferos através de processo altamente organizado e muito eficiente. No entanto, devido à complexidade do mesmo, muitos dos mecanismos de controle deste processo são ainda desconhecidos. O processo espermatogônico dura cerca de 40 a 60 dias na maioria dos mamíferos e, especificamente no homem, em torno de 70 dias. De acordo com considerações morfológicas e funcionais, a espermatogênese pode ser dividida em três fases: (a) fase proliferativa ou espermatogonial, na qual as células sofrem rápidas e sucessivas divisões; (b) fase meiótica (espermatócitos), na qual o material genético é recombinado e segregado; e (c) fase de diferenciação (espermiogênica), na qual as espermatides se transformam em células muito especializadas e estruturalmente equipadas para fertilizar o ovócito (Russell et al., 1990). Cada uma destas fases dura aproximadamente 1/3 do total do processo espermatogênico. No início da fase proliferativa, espermatogônias consideradas indiferenciadas e com características específicas ainda não completamente definidas, passam por divisões mitóticas para renovar sua população, gerando também células que darão origem aos espermatozóides em fases subseqüentes. Este tipo celular, denominado espermatogônia tronco, divide-se continuamente durante quase toda a vida adulta. Em contraste com o homem, as células germinativas na mulher cessam sua divisão antes do nascimento, diminuindo sua população com a idade (França et al., 1998).
As espermatogônias tronco são muito resistentes à grande variedade de agentes nocivos para o testículo, sendo, muitas vezes, o único tipo celular remanescente a danos severos ou prolongados (Dym, 1994). Acredita-se que a habilidade de sobrevivência destas células reside no fato de determinada parte da população de células tronco dividir-se esporadicamente. Como as espermatogônias sofrem alterações morfológicas graduais ao se diferenciarem, não existindo, portanto, critérios morfológicos seguros para caracterizá-las, a estimativa precisa do número de células tronco por testículo e isso torna-se tarefa bastante difícil (Ogawa et al., 1997). Teoricamente, uma simples espermatogônia tronco de rato é capaz de produzir 4096 espermatozóides (Russell et al., 1990). No entanto, degenerações celulares (apoptose), que ocorrem principalmente na fase proliferativa e na fase meiótica do processo espermatogênico, reduzem significativamente (de 70% a 85%) a produção final de gametas (França & Russell, 1998). Mesmo assim, em torno de 107 espermatozóides são produzidos diariamente por grama de testículo, na maioria dos mamíferos. No homem, este valor fica em torno de 106. É importante salientar que dentre todas as células do testículo, as células de Sertoli, localizadas no epitélio seminífero, são os elementos chave no controle e regulação do processo espermatogênico, sendo também as intermediadoras da ação do FSH e de andrógenos durante a espermatogênese (Sharpe, 1994).
O número de túbulos seminíferos presente em cada testículo é bastante variável. Como exemplo, pode ser citado o camundongo que possui em torno de 18 túbulos por testículo e o suino onde este número provavelmente situase em torno de várias centenas ou mesmo alguns milhares. Em geral, existem de 10 a 15 metros de túbulos seminíferos por grama de testículo (França & Russell, 1998). Estes túbulos possuem cerca de 200μm a 300μm de diâmetro, estando conectados através de suas duas extremidades à rete testis, a qual é a porção inicial de um sistema de duetos coletores composto ainda pelos dúctulos eferentes, ducto epididimário e dueto deferente. Os espermatozóides recémformados são liberados no lume dos túbulos seminíferos, passando rapidamente daí para a rete testis, dúctulos eferentes e dueto epididimário. Após permanecerem por alguns dias neste último segmento, os espermatozóides sofrem a maturação final tornando-se aptos à fecundação. Como será mostrado a seguir, a viabilidade do transplante de células germinativas e a possibilidade de manipulação destas células antes das mesmas serem transplantadas abrem novos horizontes no estudo da biologia reprodutiva.
Metodologia
Preparação e injeção da suspensão celular
As células germinativas do doador (rato ou camundongo) para cada experimento são obtidas de 10 a 20 testículos de animais com idade geralmente entre 4 e 28 dias (Brinster & Avarbock, 1994 - Brinster & Zimmermann, 1994). Esta faixa de idade é a mais adequada pelo fato dos testículos serem pequenos e os cordões testiculares/túbulos seminíferos conterem maior número de espermatogônias tronco por unidade de área, o que não ocorre em animais sexualmente maduros e com estágios mais avançados da espermatogênese. Vale ressaltar que a utilização de células germinativas primordiais (gonócitos), provenientes de fetos ou de animais com poucos dias de idade, não é muito efetiva na colonização de testículos transplantados (Brinster & Avarbock, 1994).
Após digestão através de colagenase e tripsina, os túbulos seminíferos são isolados dos outros elementos do testículo, seguindo-se os procedimentos de incubação e centrifugação, a suspensão assim obtida é armazenada até o momento da injeção. A concentração de células na diluição final é de 106 a 107 células por ml. O azul de tripan é um corante que é adicionado à suspensão celular com a finalidade de seguir a progressão do preenchimento dos túbulos seminíferos no momento da injeção e também para monitorar o número de células mortas na suspensão, o qual geralmente é menor do que 5% (Brinster & Zimmermann, 1994).Em cada animal, após incisão de 1 a 3mm na túnica albugínea, é injetado em vários túbulos seminíferos cerca de 0,4 a 0,5 ml de suspensão contendo de 10-80 x 106 células (Brinster & Avarbock, 1994; Brinster & Zimmermann, 1994; Ogawa et al., 1997; Avarbock et al., 1996; Cloutier et al., 1996). Este procedimento é executado com o auxilio de um micromanipulador e de uma pipeta para microinjeção com 40μm a 60μm de diâmetro na ponta. Estima-se que em cada animal receptor sejam injetadas em torno de 100 espermatogônias tronco (Ogawa et al., 1997).
Animais receptores
Dois modelos, ambos constituídos de camundongos sexualmente maduros, são utilizados nos transplantes de espermatogônias (Brinster & Zimmermann, 1994). No primeiro modelo experimental, os camundongos são injetados com busulfan (32-40 mg/kg) por 4 a 6 semanas, antes de serem transplantados. Este procedimento aumenta enormemente a eficiência das células transplantadas devido à destruição da espermatogênese endógena. Um outro modelo de receptor bastante empregado é o camundongo mutante W/W. Este animal é estéril devido aos problemas resultantes da falha de migração para a crista genital de praticamente todas as células germinativas primordiais, durante o período embrionário. Embora estes dois tipos diferentes de camundongos receptores não apresentem espermatogênese ativa, especialmente o camundongo mutante W/W, nos túbulos seminíferos dos mesmos, observa-se a presença de lume relativamente desenvolvido, condição necessária para a progressão e dispersão das células espermatogênicas injetadas. Este lume deve-se à secreção de fluido testicular e serve também para indicar que as células de Sertoli estão relativamente funcionais (França et al., 1994). Os níveis de testosterona no testículo dos camundongos mutantes encontram-se dentro de amplitude considerada normal (França et al., 1994).
Critérios para avaliar a eficácia do transplante
A natureza contorcida dos túbulos seminíferos, incluindo seu trajeto tanto na superfície quanto no interior do testículo, sugere que a análise da superfície do testículo, corada com azul de tripan, é um bom indicativo do grau de preenchimento dos túbulos seminíferos após a injeção celular, uma vez que é impossível medir o volume da suspensão celular que entra nos túbulos. Em geral, de 60% a 85% dos túbulos seminíferos são preenchidos com a suspensão celular injetada (Ogawa et al., 1997). Após a injeção, o aparecimento de solução corada em azul no epidídimo serve para caracterizar uma boa progressão da suspensão celular. O gene lacZ procedente da bactéria Escherichia coli e introduzido no animal doador é utilizado como marcador das células germinativas. Este gene codifica a enzima ß-galactosidase a qual pode ser visualizada histoquimicamente através de métodos específicos pela coloração azulada conferida às espermátides (Brinster & Zimmermann, 1994). Como a progressão da espermatogênese a partir de células transplantadas leva algum tempo, testículos de camundongos receptores são analisados a partir de aproximadamente dois meses após o transplante (Ogawa et al., 1997).
Possíveis vias de injeção de células germinativas
A partir do conhecimento de que o transplante de espermatogônias é uma técnica valiosa e aplicável em muitas espécies, vários procedimentos para introduzir células germinativas do doador nos túbulos seminíferos de animais receptores foram testados (Ogawa et al, 1997), utilizando-se o camundongo como modelo experimental. Os resultados encontrados demonstram que a microinjeção de suspensões celulares diretamente nos túbulos seminíferos, na rete testis ou nos dúctulos eferentes, é relativamente rápida (de 10 a 20 minutos), sendo igualmente eficiente na colonização dos túbulos seminíferos e geração de células espermatogênicas dos animais doadores nos receptores. Cada uma das abordagens citadas pode ser bastante útil dependendo dos objetivos do experimento e da espécie utilizada (Ogawa et al., 1997).
Transplante intra-específico
Estudos recentes (Brinster & Avarbock, 1994; Brinster & Zimmermann, 1994), demonstram que preparações celulares provenientes dos túbulos seminíferos e contendo espermatogônias tronco podem ser transplantadas do testículo de um camundongo para outro (transplante intra-específico ou singênico), levando à produção de espermatozóides maduros e morfologicamente normais. Além disso, os espermatozóides resultantes das células transplantadas são capazes de fertilizar ovócitos com a produção de progênie viável.
Em cerca de 70% dos testículos injetados, observa-se colonização pelas células do doador. Tanto nos animais transplantados quanto naqueles provenientes de gerações subseqüentes é possível confirmar-se que as células espermatogênicas são oriundas do doador. Estas células, após métodos de coloração específica, coram-se em azul como conseqüencia da expressão da ß-galactosidase codificada através do transgene lacZ (Brinster & Avarbook, 1994; Brinster& Zimmermann, 1994). Células espermatogênicas não são comumente observadas nos animais receptores tratados com busulfan antes do transplante. No entanto, caso a espermatogênese endógena ocorra, a mesma pode ser distinguida daquela do doador pela ausência de coloração azulada das espermátides, de acordo com critérios já mencionados.
Num outro relato (Jiang & Short, 1995), constatase que a injeção de células germinativas, provenientes de fetos e de ratos recém-nascidos, na rete testis de ratos adultos, promove o desenvolvimento de espermatogênese completa no lume dos túbulos seminíferos. Os estadios da espermatogênese estabelecida intraluminalmente estão sincronizados com aqueles do epitélio seminífero adjacente, sugerindo um controle local para a espermatogênese.
A possibilidade de se manipular as espermatogônias in vitro antes das mesmas serem transferidas para o receptor, cria novo desafio e abre novas perspectivas para os cientistas interessados em pesquisa básica em espermatogênese, infertilidade, desenvolvimento embrionário e modificações genéticas de células germinativas. Desta forma, esta abordagem experimental pode ter implicações muito valiosas na biologia reprodutiva e biotecnologia, como será comentado posteriormente.
Transplante interespecífico
O testículo é considerado como órgão imunologicamente protegido devido a vários fatores, tais como: (a) presença de altos níveis de esteróides, moléculas consideradas imunossupressivas por natureza; (b) substâncias imunossupressivas secretadas pelas células de Sertoli e, principalmente, pelo (c) isolamento físico de células consideradas como antígenos (células germinativas meióticas e pós-meióticas), propiciado pelas junções especializadas que compõem a barreira de células de Sertoli e dividem o túbulo seminífero em compartimentos basal e adluminal (Russell & Brinster, 1996). No entanto, tentativas de se transplantarem células espermatogênicas de ratos em camundongos com sistema imune normal não são ainda bem sucedidas.
Recentemente, demonstrou-se que espermatogônias tronco de ratos transplantadas em camundongos, formam espermatozóides maduros e aparentemente normais (Cloutier et al., 1996). Neste estudo, os camundongos utilizados são imunodeficientes, não possuindo linfócitos T e B maduros devido à mutação no cromossomo 16, para evitar que as células transplantadas sejam rejeitadas.
Estes animais também são tratados com busulfan por algumas semanas antes do tratamento para reduzir o número de espermatogênese endógena no receptor. Mesmo assim, são encontrados espermatozóides de ratos e de camundongos no animal transplantado, uma vez que o tratamento com busulfan não é capaz de destruir todas as espermatogônias do camundongo. No entanto, devido ao fato de espermatozóides de camundongo e de rato serem morfologicamente diferentes, não é difícil demonstrar que espermatozóides desta última espécie de roedor desenvolvem-se nos testículos de camundongos. Um dos aspectos interessantes neste tipo de transplante é o fato das células de Sertoli de camundongos serem capazes de suportar e permitir a diferenciação das células espermatogênicas de ratos.
Portanto, as células germinativas do rato devem induzir as células de Sertoli de camundongo para que as mesmas produzam os fatores e as condições adequadas para o desenvolvimento e a progressão do processo espermatogênico. Assim, de forma notável, conservam-se as condições necessárias para a interação entre células germinativas e células de Sertoli, apesar de se considerar que estas duas espécies tenham divergido há cerca de 11 milhões de anos.
A espermatogênese no rato dura cerca de 60 dias (4,5 ciclos de 13 dias), sendo em torno de 50% mais longa do que no camundongo, no qual a duração deste processo é de cerca de 40 dias (4,5 ciclos de 8,6 dias). Embora se saiba que as células de Sertoli controlam grande parte dos muitos aspectos relacionados com o processo espermatogênico, ainda não havia sido determinado como o ritmo de desenvolvimento das células germinativas seria controlado. Investigações recentes demonstram, através da utilização de radioisótopos, que as células germinativas de ratos transplantadas para o testículo de camundongos se diferenciam com a duração do ciclo característica do rato (13 dias), produzindo células com o padrão estrutural do rato (França et al., 1998). Estes dados permitem concluir que o processo de diferenciação celular durante a espermatogênese é regulado somente pelas células germinativas. Estes resultados mostram ainda como o transplante de espermatogônias pode ser uma abordagem valiosa na determinação de mecanismos de controle e de interação do processo espermatogênico.
A geração de espermatogênese, com a produção de espermatozóides normais do rato em camundongo, sugere que espermatogônias tronco de outras espécies possam também ser transplantadas para camundongos, abrindo assim novas possibilidades de transplante xenogênico e de aplicações desta abordagem experimental (Cloutier et al., 1996). No entanto, merece ser ressaltado que ainda não foi demonstrado se espermatozóides de ratos produzidos em testículos de camundongo são capazes de fertilizar ovócitos de ratas, produzindo prole viável.
Transplante a partir de células criopreservadas
Resultados bastante convincentes mostram que espermatogônias tronco de camundongos podem ser criopreservadas e posteriormente transplantadas, após descongelamento, gerando espermatozóides viáveis e morfologicamente normais em cerca de 75% dos testículos analisados (Avarbock et al., 1996). Estas espermatogônias são criopreservadas por 4 a 156 dias à temperatura de - 196ºC, através de técnicas rotineiramente utilizadas, sugerindo que células germinativas de outras espécies também podem ser criopreservadas. Em torno de 50% a 60% das células são recuperadas após serem criopreservadas, das quais cerca de 60% (1/3 da população original) são viáveis. Para confirmar o sucesso deste tipo de abordagem e mostrar que as células são do doador, células espermatogênicas de camundongo caracterizadas pela coloração azul conferida pela presença da ß-galactosidase são observadas em todos os estádios da espermatogênese, em animais receptores tratados com busulfan antes do transplante. Embora os espermatozóides resultantes deste tipo de transplante sejam morfologicamente normais, ainda não existe relato na literatura demonstrando que estas células são capazes de fertilizar ovócitos (in vitro ou in vivo), ou que uma prole viável pode ser gerada a partir destes espermatozóides.
Os espermatozóides de muitas espécies podem ser criopreservados e utilizados subseqüentemente para fertilizar os ovócitos. No entanto, esta técnica tem muitas limitações uma vez que o protocolos de criopreservação varia para cada espécie, devendo ser empiricamente determinado para muitas delas. Para várias espécies, a metodologia apropriada não é ainda estabelecida. Como os espermatozóides são células totalmente diferenciadas, eles não passam por replicação quando descongelados, não ocorrendo portanto recombinação genética de informação. A criopreservação de espermatogônias tronco pode facilitar diversos tipos de estudos que envolvam cultura celular, uma vez que o protocolo utilizado é relativamente simples, sendo essencialmente aquele empregado para a maioria das culturas de tecidos. Assim, pode-se considerar esta linhagem de células germinativas criopreservadas como biologicamente imortais, pelo fato das espermatogônias tronco sofrerem replicação e recombinação gênica durante a fase de prófase meiótica da espermatogênese (Avarbock et al., 1996).
Ultra-estrutura das células transplantadas
Transplante intra-específico
Através das microscopias de luz e eletrônica de transmissão, pode-se observar que poucos meses após a injeção, as células transplantadas formam associações celulares (estádios) características, conforme observado em secções transversais de túbulos seminíferos. As espermatogônias transplantadas são encontradas exclusivamente no compartimento basal, indicando que as células de Sertoli são capazes de reconhecer estas células, translocando-as do lume dos túbulos através das junções Sertoli-Sertoli, para este compartimento (Russell &Brinster, 1996).
Praticamente todos os túbulos seminíferos de animais transplantados apresentam espermatogênese ativa. Em aproximadamente 1/4 das secções transversais de túbulos analisadas pode se considerar que os tipos celulares característicos de uma determinada associação estão presentes, evidenciando do ponto de vista qualitativo e quantitativo a normalidade do processo espermatogênico.
Por outro lado, em muitos outros túbulos isto já não ocorre, podendo serem encontradas, por exemplo, secções transversais de túbulos com ausência de uma geração celular ou com a presença de grande número de degenerações celulares e anormalidades estruturais. No entanto, o principal problema parece ocorrer durante a fase de alongamento e condensação da cromatina das espermátides, causando degenerações com conseqüente diminuição no número destas células.
Desta forma, esta fase é um dos momentos mais críticos para a progressão das células transplantadas (Russell & Brinster, 1996). Não se sabe ainda a causa e o mecanismo destas degenerações. Provavelmente, estas anormalidades estão relacionadas com problemas inerentes às células somáticas do testículo e não às células transplantadas.Somente células de Sertoli são observadas nas regiões dos túbulos seminíferos onde as células germinativas não estão presentes. Este aspecto é característico de animais receptores nos quais células germinativas não são injetadas. No entanto, estas células de Sertoli fagocitam ativamente espermatozóides procedentes de outras regiões do testículo (Russell & Brinster, 1996). É relativamente comum encontrarem-se aglomerados de células de Sertoli com núcleos mais escuros no lume de alguns túbulos seminíferos. Estes aglomerados celulares não apresentam contato com a membrana basal e nem estão envolvidos com células germinativas, devendo, provavelvente, serem oriundos de contaminação da suspensão celular injetada no momento do transplante. No espaço intertubular, as células de Leydig são morfologicamente semelhantes àquelas descritas no camundongo normal, enquanto os macrófagos estão presentes em maior número.
Transplante interespecífico
Espermatogênese ativa de rato é observada em túbulos seminíferos de camundongos imunodeficientes e tratados com busulfan (Russell et al., 1996). Embora cerca de 1/3 dos túbulos seminíferos de camundongos apresentem espermatogênese completa, grande variação individual ocorre nos animais transplantados, à semelhança do observado no transplante singênico. As células germinativas mostram associações celulares características do rato e estão associadas com células de Sertoli caracterizadas ultra-estruturalmente como de camundongo (Russell et al., 1996; França et al., 1998). Pelo fato do tratamento com busulfan não destruir todas as células germinativas endógenas, em determinadas regiões dos túbulos seminíferos são observadas associações celulares típicas do camundongo, alguns meses após o transplante.
No entanto, em nenhuma secção transversal de túbulo seminífero verifica-se a presença de células germinativas de camundongo junto às células germinativas do rato ou células de Sertoli de rato no epitélio seminífero. As células de Sertoli e as espermátides de rato e de camundongo podem ser diferenciadas morfologicamente através de microscopia eletrônica de transmissão. No caso das células de Sertoli, os critérios utilizados para esta diferenciação são a forma e o tipo de cristas das mitocôndrias. Já no caso das espermátides, a localização das mitocôndrias e o posicionamento do sistema acrossômico, na fase inicial da espermiogênese, bem como a forma, o tamanho e o grau de condensação do núcleo das espermátides alongadas, são as características distinguíveis para estas duas espécies (Russell et al., 1996).
As células geminativas de ratos transplantadas para camundongo apresentam o mesmo padrão de degenerações e de alterações morfológicas já citadas no transplante intra-específico (Russell & Brinster, 1996; Russell et al., 1996). Estas observações reforçam a idéia de que a causa destes problemas provavelmente se localiza nas células de Sertoli as quais, de alguma forma, podem estar afetadas devido ao tratamento com busulfan ou estão, em certo grau, funcionalmente alteradas pela inatividade nos animais mutantes (W/W), utilizados como receptores.
Considerações Finais
O transplante de espermatogônias é uma nova abordagem que certamente causará grande impacto na área de biologia reprodutiva e na área de biotecnologia. Em combinação com a criopreservação, a possibilidade de utilização e os benefícios proporcionados por esta metodologia serão múltiplos. O grande desafio no momento é o estudo mais detalhado e a padronização desta valiosa abordagem experimental.
Como já foi mencionado, as espermatogônias tronco têm a habilidade de autorenovação e de dar origem a tipos celulares altamente diferenciados, propriedades que as tornam especialmente atraentes para estudos experimentais. Pelo fato das espermatogônias tronco sofrerem replicação e recombinação gênica durante a fase de prófase meiótica, pode-se considerar esta linhagem de células germinativas biologicamente imortais, quando criopreservadas.
Dentre inúmeras possibilidades, a criopreservação e o transplante de espermatogônias tronco poderão ser utilizados para se preservarem células germinativas de animais de alto valor econômico ou daqueles resultantes de experimentos raros, nos quais a preservação do material genético é muito importante. Também será uma boa alternativa para preserver animais de valor genético excepcional que morrem antes da puberdade ou que são muito velhos para se acasalarem. Animais exóticos e aqueles de espécies em perigo de extinção podendo ter suas células germinativas preservadas e utilizadas, inclusive de maneira clonal em múltiplos receptores, quando desejado. A utilização de transplantes de espermatogônias torna-se ainda uma excelente opção, quando se considera que o congelamento de embriões é um processo complexo e freqüentemente caro e que a criopreservação de espermatozóides é ineficiente para muitas espécies.
A quimioterapia normalmente leva à infertilidade por destruição das células tronco ou por comprometimento genético destas células, impedindo sua divisão. Portanto, do ponto de vista clínico, vale a pena considerar como opção a biópsia testicular e a criopreservação de espermatogônias em pacientes com câncer, antes que os mesmos sofram quimioterapia radical. As células criopreservadas poderiam, desta forma, ser posteriormente transplantadas, tal como já é feito com as células da medula óssea. A outra alternativa para estes casos seria o congelamento do sêmen, no entanto, o número e a qualidade de amostras de sêmen são freqüentemente insatisfatórios nestas condições. Além do mais, a preservação de sêmen não seria uma alternativa possível para pacientes pré-púberes. Outras situações específicas de infertilidade no homem, cuja causa seja devido à problemas localizados nas células germinativas, podem ser solucionadas com o transplante de espermatogônias procedentes de outro indivíduo.
Trabalhos recentes no homem e em camundongos demonstram que a injeção intracitoplasmática no ovócito de um simples espermatozóide ou mesmo de uma esperátide arredondada, pode resultar em fertilização e no nascimento de um individuo saudável. Portanto, não é necessário que o individuo transplantado produza muitos espermatozóides ou que a espermatogênese progrida até a fase final. No caso de indivíduos nos quais os testículos produzam células espermatogênicas somente até a fase meiótica ou espermatogonial, outros indivíduos poderiam ser utilizados como receptores para produzir espermatozóides.
Outra contribuição bastante significativa no transplante interespecífico será a possibilidade de se investigar as interações entre células germinativas e as células de Sertoli, o que irá contribuir para o melhor entendimento do processo espermatogênico. Também no caso de animais híbridos e estéreis, como por exemplo o burro, a aquisição de fertilidade poderia ser possível através do transplante de espermatogônias.
Provavelmente, a grande aplicação do transplante de espermatogônias será na manipulação genética de animais e na produção de mamíferos transgênicos. Este procedimento irá propiciar grandes avanços na agricultura e na biomedicina e se tornará viável quando for possível a introdução de genes específicos nas espermatogônias tronco, podendo ser ainda uma excelente alternativa para situações nas quais as células tronco embrionárias são de difícil obtenção. É importante ser ressaltado que um dos grandes fatores limitantes na produção de animais transgênicos, principalmente de animais domésticos, é o alto custo desta tecnologia. O custo de um camundongo transgênico fica na faixa de U$ 100, sendo que para um animal de grande porte gira em torno de U$ 25.000 a U$ 500.000 (Wall et al., 1997).
As possíveis utilizações e implicações das abordagens aqui comentadas, principalmente quando as mesmas envolverem seres humanos e o transplante interespecífico, devem ser muito bem discutidas e definidas antes de virem eventualmente ser colocadas em prática.
Apesar dos recentes avanços no transplante de células germinativas, muitos aspectos importantes relacionados com esta metodologia devem ainda ser elucidados. O sucesso do transplante de espermatogônias poderia ser maior se fossem utilizadas células isoladas e purificadas a partir de cultura e aumento da população de espermatogônias tronco in vitro. Para isto, metodologias adequadas devem ser encontradas para melhor caracterizar estas células. Também não é sabido quantas vezes ou por quanto tempo uma espermatogônia tronco pode se dividir, ou mesmo se as possíveis mutações sofridas durante as sucessivas replicações e divisões do DNA podem ou não ser acumuladas. Outro aspecto relevante diz respeito ao desenvolvimento de modelos de animais receptores mais adequados, principalmente no caso de transplantes xenogênicos.
Dym, M. Spermatogonial stem cells of the testis. Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 11287- 11289, 1994.