JBRA Assist. Reprod. 1998;02(02):103-108
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1998.2.2.06
Identificação de espermatozóides viáveis para injeção intracitoplasmática (ICSI) através do teste hiposmótico
Identification of viable spermatozoa for intracytoplasmic sperm injection (ICSI) using the hypo-osmotic swelling test
Resumo
Introdução: O presente estudo visa determinar se o teste hiposmótico (THO) é capaz de identificar espermatozóides vivos para injeção intracitoplasmática (ICSI), tanto no sêmen fresco como no congelado.
Material e Métodos: Amostras de sêmen de 11 homens normozoospérmicos foram obtidas de acordo com os critérios da OMS. Alíquotas de 100 μl foram removidas de cada espécie e submetidas à solução hiposmótica contendo frutose e citrato de sódio e à coloração de Hoescht-33258 para avaliar a vitalidade espermática. As amostras foram então diluídas com crioprotetor contendo glicerol e gema de ovo (Glycerol Test Yolk-buffer, Irvine Scientific, Santa Ana, California) (1:1, v/v), e criopreservadas pela técnica de vapor de nitrogênio líquido. Após o descongelamento, as amostras foram novamente submetidas à solução hiposmótica e à coloração de Hoescht-33258. Análise concomitante do inchaço do espermatozóide, induzido pelo THO e da vitalidade pelo Hoescht-33258 foi realizada no mesmo espermatozóide com auxílio de um microscópio de fluorescência equipado com contraste de fase. A coloração de eosinanigrosina (EN) foi utilizada para validar os resultados do Hoescht-33258.
Resultados: Elevada correlação foi observada entre espermatozóides inchados, ao THO, e vivos, à coloração de Hoescht, antes os resultados do THO e os da coloração de Hoescht 33258. Os resultados de vitalidade espermática obtidos pela coloração de Hoescht-33258 foram validados pela coloração de eosina-nigrosina (r=0,72; P<0,004).
Conclusão: O teste hiposmótico é simples, funcional e não deletério, capaz de identificar espermatozóides vivos para ICSI no sêmen fresco. Entretanto, esse teste parece não ser clinicamente útil para identificar espermatozóides vivos nas amostras criopreservadas.
Unitermos: teste hiposmótico, injeção intracitoplasmática (ICSI), criopreservação, espermatozóide humano, vitalidade espermática
Abstract
Introduction: The aim of this study is to determine the suitability of the hypo-osmotic swelling test (HOS) in identifying viable spermatozoa in fresh and frozen-thawed samples for intracytoplasmatic sperm injection (ICSI).
Materials and Methods: Semen specimens were obtained from 11 normozoospermic men according to the WHO criteria. À 100 μl-aliquot of each specimen was removed and subjected to hypo osmotic swelling in a fructose and sodium citrate solution and to Hoescht-33258 to assess viability. The specimens were then diluted with glycerol TEST-yolk buffer (Irvine Scientific, Santa Ana, California) (1:1, v/v) and cryopreserved by the liquid nitogen vapor method. After thawing and removal of the cryomedia, the specimens were again submitted to hypo-osmotic swelling and to Hoescht-33258 to assess viability. A fluorescence microscope equipped with contrast fase was used to assess viability by Hoescht in the same cell either before and after cryopreservation. Eosin-nigrosin supra-vital staining (EN) was used to validity the Hoescht viability results.
Results: A high positive correlation was seen between the presence of sperm swelling by HOS and viability by Hoescht 33258 before freezing (r=0.95, P=0.0001). After cryopreservation, a poor correlation was seen between HOS scores and Hoescht-33258. Hoescht-33258 viability results were validates by EN staining (r=0.72, P<0.0004).
Conclusion: The hypo-osmotic swelling test is a simple, functional and non-deleterious assay that can accurately detect viable spermatozoa for ICSI in fresh human sperm. However, this test may not be clinically helpful in the selection of viable cells in cryopreserved samples.
Keywords: hypo-osmotic swelling test, intracitoplasmic sperm injection, cryopreservation, human spermatozoa, sperm viability
Introdução
O sucesso das técnicas de reprodução assistida depende da existência de espermatozóides vivos. Do ponto de vista clínico, a motilidade é a maneira rotineiramente utilizada para estimar a vitalidade dos espermatozóides, uma vez que os corantes vitais podem alterar a integridade do DNA, interação entre os gametas masculino e feminino e a embriogênese, caso os espermatozóides submetidos às colorações sejam posteriormente utilizados em reprodução assistida (Eliasson et al., 1971; Mortimer, 1994). No entanto, o critério da motilidade exclui os espermatozóides imóveis, porém vivos. Essa situação torna-se crucial nos casos em que há ausência de espermatozóides móveis, como em certos casos de indivíduos paraplégicos cujos espermatozóides são obtidos por vibroestimulação peniana ou eletroejaculação, na rara síndrome de Kartagener e, mais comumente, após a obtenção de espermatozóides do epidídimo ou testículo, principalmente quando os mesmos são submetidos à criopreservação (Centola et al., 1992; Agarwal et al., 1995; Sharma et al., 1997). Em tais condições, a determinação da vitalidade espermática com o auxílio de um teste não-deletério aos espermatozóides, possibilitando assim utilizá-los clinicamente para a injeção intracitoplasmática, seria de grande valia.
Embora o teste h iposmótico (THO) tenha sido originalmente descrito como um teste de função espermática, correlacionando-se com os resultados do teste de penetração em óvulos de hamster (Jeyendran et al., 1984), outros estudos não confirmaram tal propriedade (Chan et al., 1985, 1990; Van Kooij et al., 1986; Colpi et al., 1990). Entretanto, alguns autores advogam que o THO avalia a vitalidade dos espermatozóides, pois o princípio do mesmo baseia-se na avaliação da integridade da membrana plasmática, através da capacidade da mesma realizar trocas osmóticas (Van den Saffele et al., 1992; Mortimer, 1994). Assim sendo, os espermatozóides mortos, cujas membranas não apresentam capacidade osmo reguladora, incham descontroladamente ao serem submetidos à solução hiposmótica, e rompem-se. Por outro lado, a subpopulação de espermatozóides que incha controladamente, sob as condições do teste, é composta pelos espermatozóides com membranas íntegras e, conseqüentemente, viáveis (Van den Saffele et al., 1992).
O presente estudo visa determinar se o teste hiposmótico é eficaz na identificação de espermatozóides vivos para injeção intracitoplasmática (1CS1), tanto no sêmen fresco quanto no sêmen criopreservado.
Materiais e Método
Materiais
O diluente para criopreservação (glycerol TEST yolk-buffer) e o meio para lavagem do sêmen (HEPES-Biggers-Whitten-Whittingam [BWW] modificado) foram adquiridos da Irvine Scientific (Santa Ana, CA). O corante Hoechst-33258 (bis-benzimida), a eosina e a nigrosina foram obtidas da Sigma (Sigma Chemical company, St. Louis, MO). A solução hiposmótica foi composta por citrato de sódio (7,35g), frutose (13,51g) e água destilada (1 L) (Jeyendran et al., 1984). A solução de Hoechst-33258 foi preparada através da mistura de 1 mg de Hoechst-33258 em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (Dulbecoo’s PBS), e armazenada a −20°C, protegida da luz, em alíquotas de 20μl interior de tubos eppendorf.
Coleta das amostras e análise seminal
Amostras de sêmen de 11 homens saudáveis foram obtidas por masturbação em recipientes estéreis, após abstinência sexual de 48 horas. Cada ejaculado foi incubado por 30 minutos a 37°C para permitir a liquefação. As amostras foram analisdas de acordo com os critérios estabelecidos pela OMS (WHO, 1992). O intervalo entre a coleta e a análise foi de, no máximo, 1 hora. Os doadores incluídos no presente estudo apresentavam: volume ejaculado maior que 2,0 ml, concentração espermática por ml > 20 X 106 e motilidade percentual > 50%.
Técnica de criopreservação
A técnica de criopreservação já foi descrita anteriormente (Esteves et al., 1996a). Brevemente, os frascos contendo o diluente criopreservante pronto para uso, contendo gema de ovo a 20% (vv) e glicerol a 12% (v/v) (glycerol TEST yolk buffer, Irvine Scientific, SantaAna, CA), os quais são mantidos a −20°C, foram descongelados em banho-maria a 37°C, por 20 minutos, antes de serem utilizados. Em um tubo cônico de poliestireno de 15 ml (Falcon, San Diego, CA), alíquotas do meio diluente, correspondendo a 25% do volume do ejaculado, foram adicionadas ao volume total do mesmo a cada 5 minutos e misturadas utilizando-se o misturador de alíquotas Hema-Tek (Miles; Elkhart, IND). Esse procedimento foi repetido até obter-se igual volume de meio diluente e ejaculado (proporção 1:1). A mistura final foi distribuída em tubos estéreis cilíndricos de 1,0 ml (Corning cryovials, USA), os quais foram colocados no interior de um “freezer”, a - 20°C, por 8 minutos. A seguir, as amostras foram transferidas e mantidas no vapor de nitrogênio líquido (N2L), a −79°C, por 2 horas, sendo finalmente imersas no N2L a −196°C, onde permaneceram armazenados por, pelo menos, 48 horas, antes do descongelamento. As amostras foram descongeladas em temperatura ambiente por 5 minutos, sendo a seguir transferidos para estufa de cultura a 37°C, onde permaneceram por mais de 20 minutos. A remoção do diluente crioprotetor foi realizada através da diluição do espécime descongelado com meio de HEPES-BWW modificado (1:2, v/v), enriquecido com 5% de soro-albumina humana e centrifugação por 5 minutos a 1000 rpm. O mesmo procedimento era repetido novamente pararemoção completa do diluente e o “pellet” resultante ressuspendido em 1,0 ml de BWW modificado contendo albumina.
Teste hiposmótico combinado com a determinação da vitalidade espermática
Este teste foi realizado através da mistura de 100μl de sêmen fresco ou reconstituído em meio de cultura após o descongelamento, a 1 ml de solução hiposmótica. A mistura foi incubada a 37°C por 1 hora e, ao final desse período, centrifugada a 1000rpm por 5 minutos. O sedimento de espermatozóides foi então ressuspendido em solução de 1 μg/ml de Hoechst-33258 e incubado por 10 minutos a 37°C, protegido da luz. Ao término do período de incubação, a mistura foi diluída com PBS (1:3, v/v) e centrifugada a 1000 rpm por 5 minutos, para remover o excesso de Hoechst-33258. O sedimento resultante foi então reconstituído em 50μl de PBS, a partir do qual foram realizados esfregaços em lâminas de microscopia, em triplicata. Permitiu-se que os esfregaços secassem à temperatura ambiente, sempre protegidos da luz. Após a secagem, os esfregaços foram fixados por 30 segundos em metanol, mantido a 20°C negativos, e deixados secar novamente. As lâminas foram estocadas até o momento da leitura, a qual foi realizada em um prazo de 48 horas. Utilizou-se um microscópio equipado com módulo de fluorescência e contrate de fase (Leitz Orthoplan, Germany) para a leitura das lâminas. O inchaço da cauda dos espermatozóides foi analisado sob contrate de fase, utilizando magnificação de 200x. A presença ou ausência de inchaço na cauda do espermatozóide o classificava como osmoticamente competente ou incompetente, respectivamente. O mesmo espermatozóide era, então, analisado sob fluorescência, através da interposição do conjunto de filtros apropriado para análise do Hoechst 33258 (cubo A2), sob magnificação de 1000X. O corante Hoechst-33258 impregna-se no DNA das células mortas, as quais tornam-se azul “rutilante”, porém, é excluído das células vivas, as quais aparecem em tom de azul “pálido”.
No mínimo 200 espermatozóides foram avaliados por espécime. Alíquotas de sêmen foram submetidas à coloração de eosina e nigrosina, conforme técnica preconizada pela OMS (WHO, 1992), após o descongelamento, para validar os resultados obtidos através do Hoechst-33258.
Análise estatística
O teste de Pearson com nível de significância de 0,05 foi utilizado para correlacionar os resultados do teste hiposmótico com os do Hoechst-33258 antes e após a criopreservação e entre os resultados do Hoechst-33258 e os da eosina-nigrosina após a criopreservação.
Resultados
Os resultados do teste hiposmótico e da análise da vitalidade espermática pelo Hoechst 33258 antes e após a criopreservação encontram-se na Tabela I.
Tabela I. Resultados do teste hiposmótico (THO) e da vitalidade espermática antes e após a criopreservação. Os resultados do THO estão expressos em % de espermatozóides inchados, enquanto os do Hoechst-33258 e E-N expressam % de espermatozóide vivos.
No sêmen fresco, a maioria dos espermatozóides que apresentaram inchaço após o teste hiposmótico foram classificados como viáveis pelo Hoechst-33258. A correlação positiva entre os dois testes foi altamente significativa (r=0,95; P<0,0001) (figura I).
Fig. I. Correlação entre o inchaço da cauda do espermatozóide, avaliado pelo THO e a vitalidade espermática, de acordo com o Hoechst-33258, antes da criopreservação. Observa-se correlação significativa entre a presença de espermatozóides inchados (THO) e, ao mesmo tempo, vivos (Hoechst-33358)(r=0,95; P<0,0001)
Após a criopreservação, a correlação entre os resultados do teste hiposmótico e da vitalidade obtida pelo Hoechst-33258 não se mostrou significativa (r=0,11; P=0,70) (figura IIA). Da mesma forma, não observou-se correlação entre os resultados do teste hiposmótico e da vitalidade medida pela eosinanigrosina (r=0,19; P=0,52) (figura IIB). No entanto, não houve diferença significativa nos resultados da vitalidade espermática medida pelo Hoechst-33258 ou pela eosina-nigrosina (P=0,07), e elevada correlação entre os testes foi observada (r=0,72; P=0,004) (figura III.)
Fig. II. A e B - Correlação entre o inchaço da cauda do espermatozóide, avaliado pelo THO e a vitalidade espermática, avaliada pelo Hoechst 33258 (A) e pela Eosina-Nigrosina (B), após a criopreservação. Observa-se ausência de correlação significativa entre a presença de espermatozóides inchados (THO) e, ao mesmo tempo, vivos (Hoechst-33258; r=0,11; P=0,70) (Eosina-Nigrosina; r=0,19; P=0,52).
Fig. III. Correlação entre a vitalidade espermática avaliada pelo Hoechst-33258 e pela Eosina Nigrosina, após a cripreservação. Observa-se correlação significativa entre os resultados da vitalidade espermática avaliados por ambas as técnicas (r=0,72; P=0,004)
Os valores preditivos positivo e negativo do teste hiposmótico para identificar espermatozóides vivos, encontram-se na Tabela II. O teste hiposmótico apresenta elevada sensibilidade e especificidade para identificar espermatozóides viáveis no sêmen fresco. Contudo, apresenta baixa especificidade para determinar a vitalidade dos espermatozóides criopreservados.
Tabela II. Valores preditivos (positivo e negativo) do teste hiposmótico para identificar espermatozóide viáveis em amostras frescas e criopreseryadas*
Discussão
Umadas propriedades da membrana plasmática do espermatozóide é permitir o transporte seletivo de determinadas moléculas. Assim sendo, a cauda do espermatozóide, a qual é particularmente sensível às condições hiposmóticas, “incha” se exposta a um meio hipo osmolar em relação ao intracelular, em decorrência do influxo de água e expansão da membrana plasmática. Tal alteração morfológica é facilmente observada através do microscópio óptico com contraste de fase.
Embora o teste hiposmótico (THO) tenha sido considerado inicialmente como um teste de avaliação funcional do espermatozóide (Jeyendran et al., 1984), estudos subseqüentes não validaram tal postulado (Chan et al., 1985, 1990; Van Kooij et al., 1986; Colpi et al., 1990). Alguns autores, no entanto, têm demonstrado que o teste hiposmótico possibilita avaliar a integridade da membrana plasmática, pois avalia a capacidade osmoregulatória da mesma. Outros autores (Van den Saffele et al., 1992; Mortimer, 1994; Esteves et al., 1996a) têm postulado que o teste pode ser utilizado para determinar a vitalidade espermática, fornecendo resultados semelhantes àqueles obtidos com a coloração de eosinanegrosina.
A vitalidade espermática é avaliada com segurança através de colorações específicas, como a eosinanigrosina e o Hoechst-33258. No entanto, os espermatozóides a elas expostos não devem ser utilizados clinicamente para procedimentos de reprodução assistida, pois tais substâncias podem alterar a integridade do DNA, interação entre os gametas masculino e feminino e a embriogênese. O teste hiposmótico, por outro lado, é um teste simples, funcional e não deletério para os espermatozóides, o qual pode ser utilizado não somente com finalidade diagnóstica, mas também como uma ferramenta extremamente útil na identificação de espermatozóides vivos, porém imóveis, no sêmen fresco, para subseqüente utilização na injeção intracitoplasmática (ICSI). Essa situação, embora menos comum, pode ocorrer em certos casos de indivíduos paraplégicos cujos espermatozóides são obtidos porvibroestimulação peniana ou eletroejaculação, na rara síndrome de Kartagener e, mais comumente, após a obtenção de espermatozóides do epidídimo ou testículo, principalmente quando os mesmos são submetidos à criopreservação (Centola et al., 1992Agarwal et al., 1995; Sharmaet al, 1997).
O presente estudo demonstra que o teste hiposmótico possui elevada sensibilidade e especificidade para identificar espermatozóides vivos no sêmen fresco. Embora apresente elevada sensibilidade para a determinação da vitalidade no sêmen congelado, a especificidade do teste nessas condições é baixa. Assim sendo, o THO parece ser inadequado para identificar espermatozóides imóveis após a criopreservação para procedimentos de injeção intracitoplasmática (ICSI). No entanto, a validação dos reultados obtidos no presente estudo em um programa de ICSI clínico ou experimental não foi realizada. Estamos conduzindo um estudo envolvendo um modelo experimental de ICSI utilizando oócitos de hamster para validar os resultados aqui obtidos. Neste modelo, alteramos o tempo de exposição do espermatozóide à solução hiposmótica, pois a metodologia do presente estudo é experimental e utiliza um corante para validar os resultados obtidos através do inchaço da cauda. Além disso, a exposição à solução hiposmótica por uma hora, dificultaria a aplicação prática desta sistemática nos programas de ICSI. No modelo experimental já citado, observamos que o inchaço da cauda ocorre após alguns segundos de exposição à solução hiposmótica, e definimos como 15 segundos o tempo de exposição a que fica o espermatozóide na solução. Caso o inchaço da cauda não ocorra até este limite de tempo, observamos ser pouco provável o inchaço subseqüente. Outro aspecto importante refere-se à metodologia do THO neste modelo experimental. O espermatozóide é aspirado pela micropipetade injeção a partir deumamicrogota de meio de cultura pela cabeça primeiro, ao invés da cauda, como é rotineiramente utilizado na maioria dos serviços. A seguir, a micropipeta é introduzida na microgota da solução hiposmótica e o espermatozóide é liberado gradativamente, porém, sem sair totalmente da micropipeta, ou seja, apenas a cauda do mesmo é liberada e exposta à solução hiposmótica. Uma vez ocorrendo o inchaço da cauda, o espermatozóide é aspirado novamente e liberado em outra microgota contendo polivinilpirolidona(PVP). Tal procedimento evita que haja dificuldade na aspiração do espermatozóide inchado para o interior da micropipeta, devido à desproporção entre o diâmetro da mesma e o do espermatozóide inchado.
O processo de congelamento e descongelamento ocasiona alterações estruturais significativas na membrana espermática, principalmente ao nível da membrana acrossômica, as quais podem levar à morte celular (Esteves et al, 1996b; Esteves et al, in press). No entanto, a criopreservação não af eta necessariamente a cauda do espermatozóide da mesma forma. Os resultados distintos obtidos entre amostras frescas e congeladas, no presente estudo, sugerem que o fator determinante para a sobrevida dos espermatozóides após a criopreservação é a integridade da membrana plasmática da cabeça, enquanto o THO avalia a cauda do espermatozóide. Estudos utilizando a microscopia eletrônica poderão elucidar as diferenças ultra estruturais da membrana plasmática das várias partes do espermatozóide em resposta ao processo de criopreservação.