JBRA Assist. Reprod. 1998;02(02):109-114
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1998.2.2.07
Capacidade de fertilização de espermatozóides criopreservados obtidos de pacientes com câncer na era da ICSI (intracytoplasmic sperm injection)
Fertilizing capacity of cryopreserved spermatozoa obtained from patients with cancer in the era of ICSI (intracytoplasmic sperm injection)
Resumo
Introdução: Existem poucos estudos que analisam capacidade fertilizante e taxas de gravidez atingidas com o uso de espermatozóides criopreservados de pacientes com câncer. Discussões e controvérsias existem sobre a validade da utilização do banco de sêmen em pacientes com câncer e da viabilidade dos espermatozóides após longo tempo de armazenamento em nitrogênio líquido a - 196°C. Este estudo avaliou a capacidade fertilizante destes espermatozóides e comparou os resultados da sua utilização em técnicas de reprodução assistida com pacientes inférteis não portadores de doenças malignas.
Material e Métodos: Estudamos 649 ciclos de reprodução assistida em 454 pacientes inférteis não portadores de doenças malignas em instituição brasileira e comparamos com 18 ciclos de reprodução assistida em 10 pacientes com diagnóstico de câncer em 7 instituições norte americanas. Dos pacientes inférteis sem câncer, comparamos os resultados dos ciclos com e sem fator masculino e de espermatozóides provenientes de material de punção do epidídimo e de biópsia testicular. Dos pacientes com câncer, cinco tinham Doença de Hodgkin, dois câncer de testículo, um leucemia e dois câncer de próstata. O tempo de armazenamento do sêmen variou de 14 a 135 meses (média 49, valores interquartais 24 e 82).
Resultados: A motilidade média pré criopreservação foi de 44% (valores interquartais 36% e 55%) e a concentração média total dos espermatozóides foi de 31.1 X 106 (valores interquartais 6.3 X 106 e 53.9 X 106). Após 24 horas de criopreservação, a motilidade média pós descongelamento foi de 11% (valores interquartais 6% e 35%) e a concentração média total dos espermatozóides foi de 6.6 X 106 (1.2 X 106 e 17.1 X 106). Um total de 18 ciclos de reprodução assistida foram realizados em 10 casais com uma taxa geral de gravidez de 50% por casal, com 2 nascimentos vivos, uma gravidez em andamento e 2 abortos. O índice de gravidez por ciclo de FIV ICSI foi de 36,4% com uma taxa de implantação de 13%. Estes resultados são comparáveis aos resultados obtidos em ciclos de FIV/ICSI tradicionais utilizando-se espermatozóides de pacientes sem câncer, onde obtivemos uma taxa geral de gravidez de 32,8% por casal, um índice de gravidez por ciclo de FIV/ICSI de 23%, um índice de gestação por transferência de 25,6%, com uma taxa de implantação de 13,5%.
Conclusões: 1) Estes resultados indicam que sêmen de má qualidade proveniente de pacientes com câncer, independentemente do tempo de armazenamento em nitrogênio líquido (mesmo superior a uma década), pode resultar em índices de sucesso comparáveis aos procedimentos de reprodução assistida quando utilizados espermatozóides provenientes de ejaculado ou de punção/ biópsia de epidídimo e/ou de testículo de pacientes inférteis sem doença maligna quando técnicas avançadas de reprodução assistida estão disponíveis. 2) A criopreservação de sêmen em pacientes com câncer deve ser fortemente recomendada antes de qualquer tratamento como, quimioterapia e/ou radioterapia, mesmo que o paciente tenha uma qualidade seminal muito ruim no momento inicial do diagnóstico.
Unitermos: neoplasia, câncer, criopreservação, fertilização, injeção intracitoplasmática de espermatozóides
Abstract
Introduction: There are few published reports concerning fertilization and pregnancy outcomes achieved with cryopreserved spermatozoa from cancer patients. Controversy exists regarding the value of sperm banking for these patients before therapy, whether the spermatozoa are viable after long-term storage and whether they can fertilize the ovum. This study assessed fertilization and pregnancy outcome achieved with cryopreserved spermatozoa from cancer patients using assisted reproductive techniques (ART) and compared these results with infertile patients that were submitted to assisted reproductive procedures.
Materials and Methods: We studied 649 cycles of assisted reproductive techniques (ART) in 454 infertile patients with no malignancies and compared these results with 18 cycles of ART performed in 10 cancer patients who transferred their cryopreserved semen specimens from our sperm bank to 7 outside in-vitro fertilization (IVF) programs in the U.S.A.. These patients had the following diagnoses: Hodgkin’s disease (n = 5), testicular cancer (n = 2), leukemia (n = 1), or prostate cancer (n = 2). The length of specimen storage ranged from 14 to 145 months (median 49 months, interquartile range 24 and 82 onths).
Results: The median prefreeze motility was 44% (interquartile range 36% and 55%), and the median total sperm count was 31.1 X 106 (interquartile range 6.3 X 106 and 53.9 X 106). At 24 hours after banking, the median postthaw motility was 11% (interquartile range 6% and 35%) and the median total sperm count was 6.6 X 106 (1.2 X 106 and 17.1 X 106). A total of 18 cycles of ART were performed among ten couples with an overall pregnancy rate of 50% per couple, with two deliveries, one ongoing pregnancy, and two miscarriages. The pregnancy rate per cycle of IVF and ICSI (intracytoplasmic sperm injection) was 36.4%. These results are similar to those obtained in non- cancer infertile patients, were we found a pregnancy rate of 32,8% per couple, a pregnancy rate per cycle of ART of 23%, pregnancy rate per embryo transfer of 25,6% and an implantation rate of 13,5%.
Conclusions: These results indicate that poor quality cryopreserved spermatozoa from cancer patients, irrespective of the length of storage, may provide successful results with the latest micromanipulative techniques such as ICSI.
Keywords: cancer, spermatozoa, intracytoplasmic sperm injection, cryopreservation, fertilization
Introdução
Aproximadamente 30.000 a 40.000 jovens entre 18 e 35 anos são anualmente diagnosticados com câncer nos E.U.A. (Costabile, 1993). Câncer de testículo, Doença de Hodgkin e leucemia são os tipos de neoplasias mais freqüentes nesta população (Agarwal et al., 1996). Avanços terapêuticos aumentaram substancialmente a sobrevida destes pacientes, com mais de 70% dos pacientes tratados atualmente com expectativa de vida superior a 5 anos após o diagnóstico inicial de câncer (Costabile, 1993). No entanto, o uso de terapias citotóxicas utilizadas no tratamento destas doenças, negativamente afetam os testículos, e esterilidade temporária ou permanente é uma conseqüência potencial (Berthelsen, 1987 e Milligan et al., 1989). A maioria dos pacientes com câncer nesta faixa etária ainda não completou sua família quando do início do tratamento. Portanto, um esforço para contornar a esterilidade induzida por quimioterapia e/ou radioterapia, a criopreservação de espermatozóides antes de qualquer tratamento tem sido recomendada para homens com neoplasias que queiram ter a chance de estabelecer sua prole no futuro (Sanger et al., 1992, Agarwal et al., 1995, Fossa et al., 1989, Auger et al., 1993). Entretanto, o valor do banco de sêmen nesta população ainda permanece controverso e desconhecido (Agarwal et al., 1996).
Apesar dos avanços técnicos e do conhecimento sobre criobiologia celular, o processo de criopreservação diminui a qualidade seminal (Agarwal et al., 1995, Fossa et al., 1989, Auger et al., 1993, Hendry et al., 1983). Além disso, a qualidade seminal é freqüentemente pobre em homens com doenças malignas, mesmo antes de qualquer tratamento (Costabile, 1993, Padron et al., 1997). Dúvidas existem quanto à qualidade destes espermatozóides após longo tempo em nitrogênio líquido e também se estas células podem fertilizar os oócitos. As taxas de gravidez atingidas com sêmen de pacientes com câncer é menor que a obtida com o uso de sêmen fresco ou congelado de homens normais (Berthelsen, 1987). Poucos estudos na literatura existem que examinam a fertilização e resultado de gravidez quando se utiliza sêmen criopreservado de pacientes com câncer. Sucessos na utilização deste tipo de sêmen foram descritos antes da introdução da injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICS1) (Rowland et al., 1985, Khalifa et al., 1992). Recentemente, foi descrita a primeira utilização de sêmen criopreservado de portadores de doenças malignas e ICSI (Hallak et al., 1998). Este estudo tem por objetivo a comparação dos resultados obtidos com a utilização de sêmen criopreservado de pacientes com neoplasias e pacientes submetidos a ciclos de fertilização "in-vitro" ICSI por má qualidade seminal. Também comparamos os resultados do grupo de pacientes com câncer e o grupo de pacientes em que os espermatozóides foram obtidos por punção percutânea do testículo (TESA) ou por punção percutânea do epidídimo (PESA).
Material e Métodos
Estudamos 649 ciclos de reprodução assistida em 454 pacientes inférteis não portadores de doenças malignas em 1 instituição brasileira e comparamos com 18 ciclos de reprodução assistida em 10 pacientes com diagnóstico de câncer em 7 instituições norte-americanas. Todos os pacientes com câncer tinham inicialmente criopreservado seu sêmen no banco de sêmen da Cleveland Clinic Foundation e requisitaram que as amostras fossem transferidas para instituições perto de suas residências para serem utilizadas em procedimentos de reprodução assistida. Dos pacientes inférteis sem câncer, comparamos os resultados dos ciclos com e sem fator masculino e de espermatozóides provenientes de material de punção do epidídimo e de biópsia testicular. Dos pacientes com câncer, 5 tinham Doença de Hodgkin, 2 câncer de testículo, 1 leucemia e 2 câncer de próstata. O tempo de armazenamento do sêmen variou de 14 a 135 meses (média 49, valores interquartais 24 e 82). O número de ciclos de inseminação intra-uterina (IUI), FIV tradicional, e ICSI foi obtido e correlacionado com parâmetros como: número de oócitos obtidos e fertilizados com sucesso, número de embriões transferidos e resultados das gestações conseguidas.
Processo de criopreservação
As amostras de sêmen foram obtidas por masturbação após 2 a 3 dias de abstinência sexual e deixadas liquefazer à temperatura ambiente. No grupo com câncer foram realizadas análise seminal manual e computadorizada (Cell-Trak, Model VP 110, Santa Rosa, CA, E.U.A.) antes que o sêmen fosse processado para criopreservação. Nos outros grupos somente foi realizada análise manual. Como meio crioprotetor foi utilizado o Test-yolk buffer com 20% de gema de ovo e 12% de glicerol (Irvine Scientific, Santa Ana, CA, E.U.A.), adicionado 1:1 com o sêmen. A amostra foi submetida ao vórtex e dividida igualmente entre os frascos para criopreservação.
Os frascos de criopreservação foram colocados a - 20° C por 8 minutos e depois em vapor de nitrogênio líquido a - 96° C por 2 horas. Depois foram transferidos para o nitrogênio líquido a - 196°C para armazenamento por longo tempo. Um frasco de cada paciente foi descongelado após 24 horas para análise da concentração e motilidade. As amostras ficaram criopreservadas por longo tempo. Os resultados obtidos com a utilização dos espermatozóides criopreservados e descongelados por este processo foram analisados.
Resultados
Características dos pacientes
Foram analisados 454 pacientes com infertilidade que foram submetidos a procedimentos de FIV/ICSI com sêmen ejaculado e 90 pacientes que foram submetidos a procedimentos para obtenção de espermatozóides através de punção percutânea do testículo (TESA) ou por punção percutânea do epidídimo (PESA). Estes dois grupos foram analisados independentemente e em conjunto com o grupo de 10 pacientes com câncer que utilizaram seu sêmen para técnicas de reprodução assistida. A idade média do grupo com infertilidade foi de 34,4 anos, do grupo submetido a TESA/PESA foi de 28,6 anos e do grupo com câncer foi de 32 anos.Dos pacientes com câncer, 5 tinham Doença de Hodgkin, 2 câncer de testículo, 1 leucemia e 2 câncer de próstata. A idade mediana das esposas deste grupo era de 31 anos (25 a 38 anos) no momento inicial dos procedimentos de reprodução assistida.
Características do sêmen
Um total de 94 frascos criopreservados foram utilizados pelos 10 pacientes no grupo com câncer, com uma média de 9 frascos/paciente (variação, 2 a 32). O tempo de armazenamento do sêmen variou de 14 a 135 meses (média 49, valores interquartais 24 e 82).
A motilidade média pré-criopreservação foi de 44% (valores interquartais 36% e 55%), e a concentração média total dos espermatozóides foi de 31.1 X 106 (valores interquartais 6.3 X 106 e 53.9 X 106). Após 24 horas de criopreservação, a motilidade média pós-descongelamento foi de 11% (valores interquartais 6% e 35%) e a concentração média total dos espermatozóides foi de 6.6 X 106 (1.2 X 106 e 17.1 X 106).
Resultados da análise seminal no pós descongelamento nas 7 instituições onde estes procedimentos de reprodução assistida foram realizados, não estavam disponíveis.
Resultados dos procedimentos de reprodução assistida
Um total de 18 ciclos de reprodução assistida foram realizados em 10 casais (grupo câncer) com uma taxa geral de gravidez de 50% por casal, com 2 nascimentos vivos, uma gravidez em andamento e 2 abortos. Um total de 55 ovos foram fertilizados (55 de 89, 62%) com 34 embriões transferidos. O índice de gravidez por ciclo de FIV/ICSI foi de 36,4% (4 de 11) com uma taxa de implantação de 13% ( 4 de 31). O índice de gravidez para todos os procedimentos de reprodução assistida foi de 28% (5 gestações em 18 ciclos). Os procedimentos de reprodução assistida e resultados são ilustrados na Tabela I. Foram realizados 7 ciclos inseminação intra-uterina (IUI) em 4 casais, 2 ciclos de FIV em 1 casal e 8 ciclos de ICSI em 7 casais. Uma gravidez foi estabelecida com IUI e está em andamento. Nos casais que se submeteram a FIV, não se obteve nenhuma gravidez. Nos casais onde foi utilizou-se ICSI, 3 gestações foram estabelecidas, com um nascimento vivo e 2 abortos espontâneos.
Tabela I. Tipos de Técnicas de Reprodução Assistida em Pacientes com Câncer
Analisando-se por diagnóstico, verifica-se que em um casal cujo homem tinha câncer de próstata localizado e cuja parceira se submeteu a um ciclo de ICSI, resultou numa gravidez, que resultou em aborto. Um casal cujo homem tinha Doença de Hodgkin, estabeleceu gravidez com IUI. O paciente com leucemia não obteve sucesso com nenhuma técnica empregada.
Estes resultados são comparáveis aos resultados obtidos em ciclos de FIV/ICSI tradicionais utilizando-se espermatozóides de pacientes sem câncer, em que obtivemos uma taxa geral de gravidez de 32,8% por casal, um índice de gravidez por ciclo de FIV/ICSI de 23%, um índice de gestação por transferência de 25,6%, com uma taxa de implantação de 13,5%.
Tabela II. Comparação dos resultados de técnicas de reprodução assistida utilizando-se espermatozóides de pacientes inférteis não portadores de doenças malignas (Ejaculado/TESA/PESA) com espermatozóides de pacientes com câncer
Discussão
Pacientes com câncer e sêmen de má qualidade devem criopreservar seus espermatozóides, pois independentemente da concentração e características iniciais, podem ter sucesso em estabelecer gravidez quando técnicas avançadas de reprodução assistida, e particularmente ICSI, são disponíveis. Taxas de gravidez em andamento de 31% a 37% por tentativa têm sido relatadas por centros bem treinados (Tournaye et al., 1995 e Palermo et al., 1995). O alto índice de fertilização, gravidez por ciclo e taxa de implantação atingido nos pacientes com câncer e que foi absolutamente comparável ao da população com infertilidade masculina tradicional e habitual a uma clínica de reprodução assistida, atesta a eficiência destes procedimentos. Além disso, assegura ao profissional médico e oncologista que cuida diretamente do paciente, a importância de se dar a devida atenção ao aspecto da fertilidade pós-tratamento a estas pessoas no momento mais delicado de suas vidas, quando recebem o diagnóstico de câncer e têm que se submeter a quimioterapia e/ou radioterapia. Este aspecto muitas vezes é encarado em segundo plano, e futuramente para 70% dos pacientes que conseguem sobreviver à neoplasia, representa um ônus extra ao tumor que no passado os assombrou. Abstinência sexual tem um impacto mínimo na qualidade seminal em homens com câncer e as amostras apresentam qualidades semelhantes, quando colhidas com períodos de abstinência de 24 a 48 horas e de 48 a 72 horas ou mais (Agarwal et al., 1995).
Muitas teorias têm sido aventadas para explicar a má qualidade seminal em homens com câncer. As explicações variam, mas parece que há um mecanismo ligado à própria presença do tumor (Giwercman et al., 1992), ou à presença direta de células neoplásicas no testículo, como no tumores de testículo (Giwercman et al., 1993) podem adversamente afetar a espermatogênese. Os efeitos do câncer de testículo e do seu tratamento na espermatogênese, foram estudados, porém não existem testes diagnósticos que podem predizer quais pacientes vão se tornar estéreis ou que irão retornar a serem férteis no futuro. Particularmente, nos tumores do testículo, parece que um aumento da temperatura (Weisbach et al., 1980) associado a uma mudança do fluxo sangüíneo resultando em alterações estruturais e funcionais do epidídimo (Mieusset et al., 1995). Estas alterações podem estar associadas a anormalidades vasomotoras com conseqüente perda na troca de nutrientes do sangue ao fluído intersticial (Setchell et al., 1995). Alguns investigadores questionaram se os espermatozóides de pacientes com câncer de testículo são defeituosos por natureza ou se eles perdem a qualidade após o descongelamento (Hendry et al., 1983). Outros advogam que a má qualidade após criopreservação em tumores de testículo é conseqüência da má qualidade pré congelamento que estes pacientes têm, e muitos dizem que a qualidade seminal piora à medida que o estadiamento do tumor aumenta (Agarwal et al., 1995). Nosso estudo revela que a criopreservação de espermatozóides antes de qualquer tratamento é uma ferramenta poderosa para contornar o problema de esterilidade pós-quimioterapia e/ou radioterapia. O fato de termos conseguido uma gravidez com inseminação intra-uterina, revela que neste caso em particular havia uma quantidade suficiente de espermatozóides móveis para obter fertilização após o descongelamento. No entanto, esta não é a situação mais comumente encontrada. Da maior importância, é o tempo que o banco de sêmen tem para criopreservação antes do tratamento oncológico, pois o objetivo é armazenar o sêmen no maior número de frascos possíveis, haja visto o fato de que utilizando-se ICSI, são necessários poucos espermatozóides viáveis.
Portanto, a criopreservação de espermatozóides deve ser aconselhada pelo médico responsável pelo paciente oncológico. Os colegas ginecologistas irão se deparar com pacientes do sexo masculino com tumores, pois em 25% das vezes em que existe a presença de um tumor de testículo, a apresentação inicial do paciente é de azoospermia e em 67% das vezes é de oligoastenospermia. Além disso, a incidência de tumores de testículo na população infértil masculina é de aproximadamente 20 a 30 vezes maior que a da população masculina normal, atestando a necessidade de que todo casal onde o homem tem qualquer forma de alteração seminal, deve ser avaliado por um urologista.
Berthelsen, J.G.- Testicular cancer and fertility. Int. J. Androl., 10:371, 1987.
Giwercman, A.; Skakkebaek, N. E.- The human testisan organ at risk? Int. J. Androl., 15: 373, 1992.