JBRA Assist. Reprod. 1998;02(02):115-122
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1998.2.2.08
Características da motilidade espermática avaliadas por computador, antes e após a criopreservação do sêmen pela técnica de vapor de nitrogênio líquido, em indivíduos normozoospérmicos
Charateristics of sperm motility evaluated by computer-assisted semen analysis before and after cryopreservation using liquid nitrogen vapor technique in normozoospermic men
Resumo
Introdução: O objetivo do presente estudo é avaliar as características da motilidade espermática de indivíduos normozoospérmicos, através de análise computadorizada, antes e após a criopreservação do sêmen pela técnica de vapor de nitrogênio líquido.
Materiais e Método: Amostras de sêmen de 15 indivíduos saudáveis com fertilidade comprovada foram obtidas por masturbação, após período de abstinência sexual de 48 horas. A criopreservação foi real izada pela técnica de congelamento lento em vapor de nitrogênio líquido, utilizando diluente crioprotetor (1:1, v/v) contendo glicerol e gema de ovo (glycerol TEST yolk-buffer, Irvine Scientific, Santa Ana, California). As análises da concentração e motilidade espermática percentual, velocidade linear (VL), velocidade curvilínea (VCL), velocidade da trajetória média (VTM), linearidade (LIN) e amplitude do deslocamento lateral do espermatozóide (ADL) foram realizadas por computador (Cell-Trak semen analyzer, Motion Analysis Corporation, Santa Rosa, California) antes do congelamento e após o descongelamento. A vital idade espermática (VIT) foi avaliada pela técnica de eosinanigrosina.
Resultados: Todos os parâmetros espermáticos avaliados antes da criopreservação situavam-se dentro da normalidade. Após o descongelamento, observou-se decréscimo acentuado da motilidade percentual e da vitalidade espermática em 66% e 58%, respectivamente (P<0.02), enquanto a ADL apresentou redução, porém não significativa (P=0.08). No entanto, os valores médios dos parâmetros de avaliação da qualidade da motilidade espermática, apesar de reduzidos, mantiveram-se dentro dos limites de normalidade após o descongelamento, com exceção da VTM.
Conclusão: A criopreservação de sêmen pela técnica de vapor de nitrogênio líquido acarreta decréscimo significativo da motilidade e vitalidade espermática em indivíduos normozoospérmicos. No entanto, a análise detalhada da motilidade espermática pelo computador, revela que a maioria dos parâmetros da motilidade mantém-se dentro dos limites da normalidade nos espermatozóides que sobrevivem ao processo de congelamento descongelamento. Assim sendo, a análise computadorizada dos parâmetros da motilidade é um instrumento importante na avaliação da cinética dos espermatozóides criopreservados, pois fornece informações mais específicas do que as obtidas pela simples análise da motilidade percentual.
Unitermos: Criopreservação, espermatozóide humano, análise seminal computadorizada, vitalidade espermática
Abstract
Introduction: The aim of this study was to evaluate the characteristics of sperm motility in normozoospermic men, before and after cryopreservation using the liquid nitrogen vapor technique.
Materials and Methods: Semen samples were obtained from 15 healthy individuals with proven fertility. After abstinence of 48 hours, the ejaculates were collected by masturbation into sterile specimen cups. Slow-rate freezing using the liquid nitrogen vapor technique and TEST yolk-buffer with glycerol (1:1, v/v) as a cryoprotective agent were the major components of the cryopreservation technique. Sperm samples were analyzed on a computer-assisted motion analyzer (Motion Analysis;Cell-Trak, Santa Rosa, California) before freezing and after thawing. Samples were analysed for percent motility, straight-line velocity (VSL), cuvilinear velocity (VCL), average path velocity (VAP), linearity (LIN) and amplitude of lateral head displacement (ALH). Sperm viability was assessed by eosin-nigrosin staining before freezing and after tawing.
Results: All seminal parameters were within normal range before freezing. Percent motility and viability showed significant decrease, 66% and 58%, respectively (P<0.0001) after thawing. Similarly, VSL, VCL, VAP and LIN significantly decreased (P<0.02) after cryopreservation. However, the percent change in ALH was statically significant (P=0.08). In spite of the decrease of all motion parameters, the mean value still remained within normal range after thawing, except for VAP.
Conclusion: Motility and viability are significantly impaired after cryopreservation of semen using the liquid nitrogen vapor technique in normozoospermic men. However, spermatozoa that survive the freeze-thawing process retain the majority of their motion characteristics within normal ranges, as evaluated by computer-assisted semen analysis. Computerized sperm analysis is an important tool to evaluate kinematics of cryothawed spermatozoa, since it yields more specific information than routine sperm analysis.
Keywords: cryopreservation, human spermatozoa, computer-assisted semen analysis, sperm viability
Introdução
A criopreservação de sêmen humano para utilização em reprodução assistida é um procedimento mundialmente reconhecido. Bancos de sêmen são utilizados para armazenar espermatozóides previamente a procedimentos cirúrgicos que possam comprometer a fertilidade futura, antes de vasectomias e antecedendo tratamentos quimioterápicos e/ou radioterápicos para casos específicos de câncer (Agarwal et al., 1995), os quais geralmente ocasionam aplasia germinativa, a qual pode ser temporária ou definitiva. Além disso, bancos de sêmen são utilizados para fornecerem sêmen de doador para casais inférteis (Byrd et al., 1990). Nas inseminações artificiais com sêmen de doador é mandatória a utilização de sêmen congelado, o qual deve ser mantido sob quarentena de, no mínimo, 6 meses para descartar a presença da síndrome da imunodeficiência adquirida, entre outras doenças sexualmente transmissíveis (Sherman et al., 1987; Linden et al., 1997). Mais recentemente, a criopreservação tem sido empregada para armazenar espermatozóides excedentes aspirados do epidídimo ou testículo, para eventual utilização em procedimentos de reprodução assistida de alta tecnologia (exemplo: injeção intracitoplasmática do espermatozóide no óvulo [ICSI]), e para armazenar espermatozóides obtidos durante microcirurgias reconstrutivas no trato genital masculino (vaso-vaso e vaso epididimoanastomose), como garantia adicional de fertilidade (Witt et al., 1995; Sharma et al., 1997).
A diminuição do potencial fértil dos espermatozóides após o descongelamento é um dos principais fatores limitantes para o sucesso da inseminação intra-uterina e da fertilização in vitro convencional envolvendo sêmen criopreservado. Mesmo utilizando-se técnicas avançadas de criopreservação, 25 a 75% dos espermatozóides morrem ou são lesados irreversivelmente durante esse processo (Centola et al., 1992). A qualidade inicial da amostra, o número de espermatozóides móveis após o descongelamento e os parâmetros da motilidade espermática, avaliados através da análise computadorizada, são preditivos do potencial fértil do sêmen congelado (Brown et al., 1988; Marshburn et al., 1992).
O presente estudo visa avaliar as carcterísticas da motilidade espermática de indivíduos normozoospérmicos, através de análise computadorizada, antes e após a criopreservação do sêmen pela técnica de vapor de nitrogênio líquido.
Material e Métodos
Amostras de sêmen de 15 doadores saudáveis, participantes do Programa de Banco de Sêmen de Doador da Fundação “Clevaland Clinic”, foram obtidas por masturbação em recipientes estéreis, após abstinência sexual de 48 horas. Cada ejaculado foi incubado por 30 minutos a 37°C para permitir a liquefação. As amostras foram analisadas de acordo com os critérios estabelecidos pela OMS (WHO, 1992). O intervalo entre a coleta e a análise foi de, no máximo, 1 hora.
Após análise macroscópica das amostras liquefeitas, a qual incluía medida do volume ejaculado, pH, observação de cor, aspecto, liquefação e viscosidade, procedeu-se a análise dos parâmetros espermáticos microscópicos utilizandos-se um analizador computadorizado de sêmen “Cell-Trak”, modelo VP 110 (Motion Analysis Corporation, Santa Rosa, California). Para cada determinação, 5μL de sêmen foram acondicionados na câmara de contagem tipo Microcell (Conception Technologies, La Jolla, CA), e processados pelo computador. As amostras foram avaliadas quanto à concentração de espermatozóides total e por ml, motilidade percentual (MOT = percentual de espermatozóides móveis na amostra estudada), velocidade linear (VL=velocidade de progressão linear do espermatozóide, a qual é obtida a partir da distância linear percorrida pelo espermatozóide do ponto inicial ao ponto final da trajetória estudada, em função do tempo, medida em micrômetros por segundo), velocidade curvilínea (VCL=calculada a partir da soma das linhas retas que interligam as posições seqüenciais ocupadas pelo espermatozóide ao longo de sua trajetória, em função do tempo, medida em micrômetros por segundo), velocidae da trajetória média (VTM=traduz a velocidade ao longo da trajetória espacial “média” do espermatozóide, medida em micrômetros por segundo), linearidade (LIN=relação VL/VCL; traduz a linearidade da trajetória curvilínea do espermatozóide) e, amplitude do movimento lateral da cabeça do espermatozóide (ADL=expressa o deslocamento lateral da cabeça do espermatozóide em relação à sua trajetória média, medido em micrômetros). Os valores de normalidade foram assim definidos: volume do ejaculado >/=2,0 ml; concentração total de espermatozóides >40 x 106; concentração de espermatozóides por ml >20 x 106; MOT >50%; VL>15μm/s; VCL>30Mm/s; LIN>19 e ADL>2,0μm. Diluição apropriada foi utilizada nas amostras com número de espermatozóides superior a 40 x 106/ml, com o objetivo de ajustar a concentração para uma faixa situada entre 20 e 40 x 106/ml, assegurando-se assim, a leitura computadorizada adequada. Os critérios para inclusão dos doadores no presente estudo foram: volume ejaculado maior que 2,0ml, concentração espermática por ml>20 x 106 e motilidade percentual >50%. Aproximadamente 200 espermatozóides de, pelo menos, 4 diferentes campos foram avaliados pelo computador em cada espécime.
Técnica de criopreservação
Utilizou-se como agente crioprotetor, um diluente pronto para uso, disponível comercialmente, contendo gema de ovo a 20% (v/v), glicerol a 12% (v/v), 85 mM de Tris ([hidroximetil]amino metano), 189 mM TES (nTris[hidroximetil] metil-2-amino-etanoácido sulfônico), 11 mM de glicose, o,25 mg/ml de estreptomicina, 0,15 mg/ml de penicilina e pH=7,35 (TEST yolk-buffer, Irvine Scientific, Santa Ana, CA). Os frascos contendo o diluente criopreservante mantiveram-se armazenados a −20°C e foram descongelados em banho-maria a 37°C, por 20 minutos, antes de serem utilizados. Em um tubo de poliestireno de 15 ml (Falcon, San Diego, CA), alíquotas do meio diluente, correspondendo a 25% do volume do ejaculado, foram adicionadas ao volume total do mesmo a cada 5 minutose misturados utilizando-se o misturador de alíquotas Hema-Tek (Miles; Elkhart, IND). Esse procedimento foi repetido até obter-se igual volume de meio diluente e ejaculado (proporção 1:1). A seguir, a mistura final foi distribuída em tubos estéreis de plástico, cilíndricos, com base cônica, capazes de acondicionar 1,0 ml da mistura cada (Corning cryovials, USA). Após a identificação dos tubos com o nome e o código de congelamento do doador, os mesmos foram acondicionados em suportes metálicos próprios para utilização em tambor de nitrogênio. Cada suporte metálico possui capacidade para alocar 6 tubos cilíndricos. No entanto, no máximo, 2 tubos foram alocados em cada suporte, nas posições 1 e 2, ou seja, nas duas posições mais superiores. Utilizou-se técnica asséptica durante todo o processo de diluição e acondicionamento das amostras.
O congelamento propriamente dito foi realizado através da técnica de vapor de nitrogênio líquido (congelamento lento), a qual consistiu-se de 3 etapas consecutivas (Sherman, 1964):
a) Fase de resfriamento: os suportes metálicos contendo os tubos cilíndricos com a amostra foram colocados no interior de um “freezer”, com temperatura ajustada para 20°C negativos, na posição horizontal, sendo então, mantidos nesse ambiente por 8 minutos;O descongelamento das amostras também foi realizado de maneira lenta. Os tubos cilíndricos foram removidos do tambor de armazenamento e mantidos à temperatura ambiente por 5 minutos. A seguir, foram transferidos para estufa de cultura a 37°C, onde permaneceram por mais 20 minutos. A remoção do diluente crioprotetor foi realizada através da diluição do espécime descongelado com meio de HEPES-BWW modificado (HEPES-Biggers-Whitten-Whittingam, Irvine Scientific, Santa Ana, CA) (1:2, v/v), enriquecido com 5% de soroalbumina humana e centrifugação por 5 minutos a 1000 rpm. O mesmo procedimento era repetido novamente para remoção completa do diluente e o “pellet” resultante ressuspendido em 1,0 ml de BWW modificado contendo albumina. A seguir, após calibragem do computador para a leitura de amostras “lavadas”, de modo a alterar o número de quadros capturados de 15 por segundo (sêmen fresco) para 30 por segundo, procedeu-se a mesma sistemátic já descrita para análise dos parâmetros seminais antes do congelamento.
b) Fase de congelamento: os suportes metálicos contendo os tubos cilíndricos foram transferidos para a caneca do tambor de nitrogênio líquido (N2L), sendo que cada suporte foi colocado na posição vertical, com os dois tubos cilíndricos situados nas posições mais superiores. A caneca foi então transferida para o tambor contendo nitrogênio liquido apenas na base, de modo que o tubo cilíndrico mais inferior situou-se a 15 cm do nível do N2L e o tubo superior a 18 cm. A temperatura na posição ocupada pelos tubos cilíndricos situou-se ao redor de −79°C, e os mesmos foram mantidos nesse ambiente fechado de vapor de N2L por um período de 2 horas. A verificação do nível do N2L foi realizada de forma sistemática antes do início do processo de criopreservação.
c) Fase de armazenamento: após 2 horas no vapor de N2L, os suportes metálicos contendo os tubos cilíndricos foram transferidos imediatamente para outro tambor (tambor de armazenamento), sendo então imersos em N2L a −196°C, onde permaneceram armazenados por, pelo menos, 48 horas.
Tripla análise manual da concentração e motilidade percentual espermática foi realizada em todas as amostras, antes e após a criopreservação, para validação dos resultados obtidos pelo computador.
Observando-se diferença superior a 20% entre as análises por computador e manual, os valores obtidos pela contagem manual eram mantidos, descartando-se os valores correspondentes obtidos na análise computadorizada.
A vitalidade espermática (VIT) foi avaliada através da coloração de eosina e nigrosina, conforme sistemática preconizada pela OMS (WHO, 1992), antes e depois da criopreservação.
Análise estatística
Utilizou-se o teste de análise de variância (ANOVA) para avaliação da alteração percentual dos parâmetros espermáticos de antes para depois da criopreservação. Valores de P</=0,05) foram considerados significantes.
Resultados
Os valores da motilidade percentual, dos parâmetros da motilidade espermática, ou seja, VCL, VL, VTM, LIN e ADL e da vitalidade espermática, estão distribuídos na Tabela I. Previamente à criopreservação dos espermatozóides, esses valores situavam-se dentro da normalidade.
TABELA I. Parâmetros espermáticos de 15 indivíduos nòrmozoospérmicos antes e depois da criopresèrvação*
A criopreservação causou deterioração de todos os parâmetros estudados (Tabela I). Houve redução significativa da motilidade percentual e vitalidade espermática em 66% e 58%, respectivamente (P<0,0001) (Tabela I, figura I). Também observou-se redução significativa dos parâmetros de avaliação da motilidade espermática após o descongelamento das amostras (P<0,02), com exceção da amplitude do deslocamento lateral do espermatozóide, a qual apresentou redução, porém não significativa (P=0.08). Apesar da redução obserada, os valores médios dos parâmetros da motilidade espermática, com exceção dos valores da VTM, permaneceram dentro dos limites de normalidade apeos a criopreservação (Tabela I)
Figura I. Distribuição gráfica dos parâmetros seminais que apresentaram variação percentual mais significativa de antes para depois da criopreservação. O retângulo corresponde aos valores situados entre os percentis 25 e 75. A linha horizontal no interior do retângulo corresponde à medida e as linhas estendem-se por 95% dos dados.
Discussão
A disseminação das técnicas de reprodução assistida aumentou a demanda pela criopreservação, uma vez que os gametas excedentes não utilizados em um ciclo de tratamento poderiam ser estocados para eventual utilização futura. Da mesma forma, vários autores têm preconizado a criopreservação dos espermatozóides aspirados diretamente do canal deferente ou do epidídimo durante os procedimentos microcirúrgicos para reconstrução do sistema ductal extra-testicular, como a vaso vasostomia e a vasoepididimostomia, com o objetivo de assegurar a fertilidade futura (Witt et al., 1995; Sharma et al., 1997). Inúmeros bancos de sêmen têm estocado espermatozóides de homens que irão submeter-se a certas formas de rádio e quimioterapia ou a procedimentos cirúrgicos envolvendo o sistema ductal ou os órgãos emissores, os quais podem, potencialmente, causar esterilidade. Por outro lado, na reprodução artificial empregando sêmen de doador, a utilização de sêmen congelado faz-se mandatória para descartar a presença da síndrome da imunodeficiência adquirida e outras doenças sexualmente transmissíveis (Sherman, 1987; Linden et al., 1997).
O desenvolvimento das técnicas de criopreservação de espermatozóides não tem acompanhado o aprimoramento sofrido pelas técnicas de reprodução assistida, de modo que o sucesso de determinados procedimentos, como a inseminação intra-uterina e a fertilização “in vitro” convencional, é inferior quando se utiliza sêmen criopreservado em comparação com os resultados utilizando sêmen fresco. Mesmo utilizando técnicas modernas de criopreservação, as quais incluem o uso de novos diluentes crioprotetores, técnicas de congelamento lento e o descongelamento utilizando “freezer” programado, a qualidade dos espermatozóides recuperados após o descongelamento permanece insatisfatória (Centola et al., 1992; Marshburn et al., 1992; Agarwal et al., 1995). Resultados promissores, entretanto, têm sido obtidos com técnicas que visam melhorar a qualidade dos parâmetros seminais previamente à criopreservação (Esteves et al., 1997, 1998).
Os efeitos da criopreservação sobre os espermatozóides incluem diminuição da motilidade espermática (Keel et al., 1987), alterações no padrão de penetração no muco cervical (Fjallbrant et al., 1969), diminuição da penetração em oócitos de hamster (Critser et al., 1987), alterações na estrutura acrossômica (Cross et al., 1991; Esteves et al., 1996a; Esteves et al, in press) e na membrana plasmática (Esteves et al., 1996b), além da diminuição da atividade da protease acrossômica (acrosina) (Mack et al., 1987). Dois fatores principais estão envolvidos da fisiopatologia desses eventos, ou seja, os efeitos osmóticos do processo congelamento-descongelamento sobre a membrana plasmática dos espermatozóides, levando a alterações da permeabilidade celular e morte celular (Watson et al., 1992); e o dano subletal, o qual decorre de uma combinação de fatores que incluem: desidratação e rehidratação celular, além de alterações na bioquímica e fisiologia celular (diminuição da atividade enzimática, ativação da cascata da peroxidação lipídica, com conseqüente geração de radicais livres, etc.) (Barthelemy et al., 1990).
Devido à complexidade dos mecanismos envolvidos no processo de criopreservação, a avaliação do potencial fértil dos espermatozóides recuperados após o descongelamento através dos parâmetros do espermograma convencional é inadequada. Para tal, testes mais sofisticados são necessários, como avaliação computadorizada dos parâmetros da motilidade espermática, testes de capacitação espermática, avaliação da integridade acrossômica e da capacidade de reação acrossômica induzida por estímulos específicos (Esteves et al., 1997). Porém, alguns desses testes, especialmente os utilizados para avaliação acrossômica, não encontram-se disponíveis para utilização clínica na maioria dos laboratórios de andrologia, pois são de realização laboriosa e exigem equipamento sofisticado. Por outro lado, a análise computadorizada dos parâmetros da motilidade para a avaliação do potencial fértil dos esperrnatozóidess criopreservados é facilmente executável e vários estudos demonstram existir correlação positiva entre o número de espermatozóides móveis após o descongelamento , os valores da VL e VCL e a capacidade de fertilização do espermatozóide (Brown et al., 1988; Byrd et al., 1990; Marshburn et al., 1992).
O protocolo de criopreservação adotado no presente estudo utilizou a técnica de vapor de nitrogênio líquido com fases estáticas. Esta técnica foi descrita por Sherman em 1964 e continua sendo amplamente utilizada até os dias atuais, pois trata-se de uma técnica simples, de baixo custo, que dispensa o uso de equipamentos aumotamizados e possibilita a manutenção da qualidade e da sobrevida de frações significativas dos espermatozóides após o descongelamento (Sherman, 1964, 1986; Agarwal et al., 1995). No presente estudo, utilizou-se ainda um meio diluente pronto para uso, disponível comercialmente e que é submetido a um rígido controle de qualidade, simplificando assim o procedimento, pois não há necessidade do preparo do diluente criopreservante no laboratório. Tal diluente vem sendo empregado por diversos bancos de sêmen em vários países e tem se mostrado eficaz para reduzir a formação de gelo intracelular, bem como para estabilizar os fosfolipídeos da membrana plasmática do espermatozóide humano (Jeyendran et al., 1984, 1985; Agarwal et al., 1995).
Outra particularidade digna de nota foi o tipo de envase, utilizado no presente estudo. Utilizou-se tubos cônicos fabricados em material plástico e resistente às baixas temperaturas, com capacidade para armazenar 1,0ml da mistura sêmen/diluente cada. Tais tubos possuem base cónica com ranhuras que facilitam as trocas de calor. Esta metodologia de envase facilita a manipulação da amostra, tanto no momento do enchimento dos tubos quanto após o descongelamento, pois o diâmetro destes tubos é maior do que o das pailetes de polipropileno, as quais são rotineiramente utilizadas pela maioria dos bancos de sêmen e, além disso, o fechamento dos mesmos é realizado com tampas que possuem mecanismo de rosca, fato este que também simplifica o processo, pois no caso das pailetes há necessidade de selar as suas extremidades. A criopreservação de sêmen humano utilizando os tubos citados fornecem resultados semelhantes aos obtidos com as pailetes de polipropileno (Mortimer, 1994).
No presente estudo, se levássemos em consideração apenas os valores da motilidade percentual e da vitalidade após o descongelamento, parâmetros estes mais utilizados na análise seminal convencional, concluiríamos ter redução significativa dos mesmos para níveis considerados anormais, porém, nenhuma informação acerca da qualidade da motilidade dos espermatozóides que sobreviveram ao processo de criopreservação seria obtida. Entretanto, ao analisarmos a cinética espermática por computador, verificamos que os valores médios dos parâmetros que avaliam a motilidade dos espermatozóides que sobreviveram ao processo congelamento-descongelamento, apesar de reduzidos, mantiveram-se dentro dos padrões de normalidade, com exceção da velocidade do trajeto médio. Assim sendo, a análise computadorizada dos parâmetros da motilidade é um instrumento importante na avaliação da cinética dos espermatozóides criopreservados, pois fornece informações mais específicas do que as obtidas pela simples análise da motilidade percentual.
Sherman, J. K.- Low temperature research on spermatozoa and eggs. Cryobiology, 1: 103-129, 1964.