JBRA Assist. Reprod. 1998;02(03):27-30
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1998.2.3.04
“Assisted hatching” com diodo laser em pacientes ≤ 37 anos e sem folhe de implantação: um estudo prospectivo e randomizado
Assisted hatching with a laser diode in patients ≤ 37 years old with no previous failure of implantation: prospective randomized study
*Professor de Tocoginecologia do Curso de Ciências Médicas da Universidade de Ribeirão Preto (UNAERP)
Resumo
Introdução: O “Assisted Hatching” (AH) é uma técnica utilizada para melhorar as taxas de gravidez em pacientes com idade ≥ 38 anos e/ou que apresentaram falhas anteriores de implantação. O objetivo do estudo foi avaliar se o AH possui algum efeito benéfico em pacientes com idade inferior a 37 anos e que estão sendo submetidas a primeira tentativa de ICSI.
Material e Métodos: Um total de 60 pacientes que foram submetidas pela primeira vez a ICSI e que tinham idade ≤ 37 anos, foram de maneira prospectiva e randomizada divididas em 2 grupos: grupo I - Pacientes submetidas ao AH (n=25), para o procedimento foi utilizado um diodo laser com comprimento de onda de 1.48 μm (Fertilaser); grupo II - Pacientes sem AH (n=35), em ambos os grupos a transferência embrionária foi realizado no 2º dia.
Resultados: A idade das pacientes do grupo I (31.72 ± 3.70 anos) não diferiu (p=0.85) das pacientes do grupo II (31.54 ± 3.65). O número de embriões transferidos foi semelhante (p= 0.60) entre os dois grupos (grupo I = 2.76 ± 0.92; grupo II = 2.89 ± 0.67). A espessura da zona pelúcida dos embriões do grupo I (16.52 ± 1.65 μm) não diferiu (p = 0.35) da espessura dos embriões do grupo II (16.87 ± 1.77 μm). A taxa de implantação embrionária (24.63%) e de gravidez clínica por transferência de embriões (44%) do grupo I foi superior as obtidas no grupo II (19.8%; 37.14% respectivamente), entretanto estas diferenças não foram estatisticamente significantes (p=0.45 e p=0.60).
Conclusões: O AH melhorou a taxa de implantação e gravidez em pacientes com idade ≤ 37 anos e sem falhas anteriores de implantação, entretanto até o momento esta diferença não se demonstrou significante.
Abstract
Introduction: “Assisted Hatching” (AH) is a technique used to improve pregnancy rates among patients ≥ 38 years old and/or patients presenting previous failure of implantation. The objective of the study was to determine whether AH (thinning) has a beneficial effect on patients younger than 37 years who are being submitted to the first ICSI attempt.Material and methods:A total of 60 patients submitted to ICSI for the first time and aged ≤ 37 years were divided into 2 groups in a prospective and randomized manner (drawing lots): group I - Patients submitted to AH (n=25); a laser diode with 1.48 μm wavelength (Fertilaser) was used for the procedure; group II - Patients with no AH (n=35). In both groups, embryo transfer was performed on the 2nd day.
Results: The age of group I patients (31.72 ± 3.70) did not differ (p=0.85) from that of group II patients (31.54 ± 3.65). The number of embryos transferred was similar (p= 0.60) for the two groups (group I = 2.76 ± 0.92; group II = 2.89 ± 0.67). The thickness of the zona pellucida of group I embryos (16.52 ± 1.65 μm) did not differ (p= 0.23) from that of group II embryos (16.87 ± 1.77 μm). The rate of embryo implantation (24.63%) and the rate of clinical pregnancy per embryo transfer (44%) were higher for group I than for group II (19.8% and 37.14%, respectively), but the difference was not significant (p=0.45 and p=0.60).Discussion:AH of the thinning type in patients aged ≤ 37 years and with no previous failure of implantation led to higher implantation and pregnancy rates than in controls, although thus far the difference has not reached significance.
Introdução
Atualmente, os casais frequentemente necessitam de técnicas de reprodução assistida para solucionar seus problemas de infertilidade. A fertilização “in vitro” (FIV) permanece como uma das principais técnicas utilizadas. Entretanto, as taxas de sucesso após FIV, levando em consideração o número de embriões que conseguem se implantar, é ainda baixa.
Em 1989, Cohen et al. relataram que a implantação embrionária seguida a FIV raramente excedia a 12% em ciclos estimulados, enquanto 16% tem sido relatado em ciclo natural, ambos valores menores do que do que os 25% de taxa de concepção em ciclos naturais de casias férteis normais. Consequentemente, muitas tentativas têm sido realizadas para melhorar a implantação após a FIV, incluindo a optimização do desenvolvimento folicular, melhora dos sistemas de cultivo (Bongso, 1991) e a micromanipulação da zona pelúcida (ZP) (Cohen et al. 1992). Tem sido relatado que em torno de 25-30% dos embriões de FIV realizam o processo de “hatching” in cultura (Dokras et al. 1991) e isto poderia significantemente contribuir para as baixas taxas de implantação após FIV.
O “assisted hatching” (AH) é uma técnica proposta para melhorar as taxas de gravidez em pacientes com idade ≥ 38 anos e/ou que apresentaram falhas anteriores de implantação. O objetivo do estudo foi avaliar se o AH com laser possui algum efeito benéfico em pacientes com idade inferior a 37 anos e que estão sendo submetidas `a primeira tentativa de ICSI.
Material e Métodos
Um total de 60 pacientes que foram submetidas pela primeira vez a ICSI e que tinham idade ≤ 37 anos, foram de maneira prospectiva e randomizada divididas em 2 grupos: grupo I: pacientes submetidas ao AH (n=25); grupo II: pacientes sem AH (n=35).
Na estimulação ovariana prévia ao procedimento de ICSI, utilizou-se um bloqueio de 2ª fase com acetato de leuprolide na dose de 0.5 mg por dia (Lupron, Abbott). Habitualmente, 14 dias após o uso do análogo e estabelecido o bloqueio, iniciou-se o uso de FSH puro (Metrodin-HP, Serono) ou FSH recombinante (Gonal F, Serono) na dose fixa de 150UI a 225 UI pelo período de 7 dias. No oitavo dia da estimulação ovariana, teve início a monitorização do desenvolvimento folicular somente por ultra-som vaginal, sendo as doses de FSH puro adaptadas com a resposta ovariana, quando foram observados um mínimo de 3 folículos com diámetro ≥ 17 mm, a gonadotrofina coriônica humana (hCG) foi administrado na dose de 10.000 UI. Os oócitos foram coletados dos folículos através de punção transvaginal guiado por ultra-som, 34-36 horas após hCG. Após identificação no fluido folicular, os oócitos foram classificados pela maturidade. O complexo cumulus-corona foi removido pela exposição em solução de hialuronidase type IV (H-4272, Sigma Chemical Co., USA) na concentração de 80 UI/ml. Os oócitos desnudados foram incubados em meio IVF-50 (Scandinavian IVF Science AB, Sweden) até o momento do ICSI.
Na separação dos espermatozóides do fluido seminal foi usado gradientes descontínuos de Sperm-Prep-100TM (Scandinavian IVF Science AB, Sweden), nas frações 40% e 90%.
A ICSI foi performada em um microscópio invertido Olympus IMT-2 equipado com sistema de lentes Hoffman, e acoplado com um micromanipulador automático e injetores.
Uma solução de 10% polivinilpirrolidina (PVP-ICSI-100, Scandinavian IVF Science AB, Sweden) diluída em IVF-50 foi usada para imobilizar os espermatozóides. A solução viscosa de PVP é produzida especialmente para o procedimento de ICSI, e testada previamente para a presença de DNA e endotoxinas (Svalander et al., 1995).
O primeiro corpúsculo polar foi posicionado às 6:00 horas, e a micropipeta com espermatozóide, introduzida horizontalmente na posição de 3:00 horas dentro do ooplasma . Gentil sucção é aplicada cuidadosamente para quebrar o oolema e evidenciar a presença de ooplasma dentro da micropipeta, confirmando a deposição intracitoplasmática do espermatozóide. O espermatozóide imobilizado é inserido junto com o ooplasma aspirado, com um mínimo volume possível de PVP (Svalander et al., 1995). Os oócitos são observados 16 a 18 horas do procedimento para determinar a presença ou ausência de pronúcleos. O processo de fertilização normal é definido pela formação de dois pronúcleos distintos, seguido pelo aparecimento de clivagem embrionária após 24 horas da fertilização.
“Assisted hatching” foi realizado com um diodo laser (Fertilaser - MTM, Medical Tecnologies Montreux -Switzerland) com comprimento de onda de 1.48 μm o qual opera através de um objetiva acoplada em microscópio invertido Eclipse TE300.
No momento da transferência, os embriões (2º dia) foram colocados em grupos de 1 a 4 em placas Nunc contendo meio de cultura (IVF).
Em seguida, utilizando a platina do microscópio, sem utilizar micromanipuladores para a fixação do embrião, o embrião foi posicionado no campo óptico e a ZP focada em direção a luz do laser.
O afinamento da ZP foi então realizado com uma única irradiação de 10 ms, suficiente para afinar a ZP em ~ 15 μm. A espessura da ZP foi medida através de uma escala presente na ocular do microscópio.
Após a realização do procedimento de “hatching”, os embriões foram transferidos para novo meio de cultura, a fim de evitar possível toxicidade dos produtos derivados da ação do laser nos componentes orgânicos da ZP, A transferência embrionária foi realizada imediatamente após o procedimento.
Resultados
A idade das pacientes do grupo I (31.72 ± 3.70) não diferiu (p=0.85) das pacientes do grupo II (31.54 ± 3.65). O número de embriões transferidos foi semelhante (p= 0.60) entre os dois grupos (grupo I - 2.76 ± 0.92; grupo II - 2.89 ± 0.67). A espessura da zona pelúcida dos embriões do grupo I (16.52 ± 1.65 μm) não diferiu (p = 0.23) da espessura dos embriões do grupo II (16.87 ± 1.77 μm). A taxa de implantação embrionária (24.63%) e de gravidez clínica por transferência de embriões (44%) do grupo I foi superior as obtidas no grupo II (19.8% e 37.14%, respectivamente), entretanto estas diferenças não foram significantes (p=0.45 e p=0.60) (Tabela I).
Tabela I. Resultados do “assisted hatching” por laser em pacientes ≤ 37 anos sem falha anterior de implantação.
Discussão
Um aspecto comum na cultura de embriões pré-implantação é o retardo do desenvolvimento quando comparado com as condições “in vivo” (Harlow e Quinn, 1982). Isto poderia resultar num decréscimo ou bloqueio nas taxas de clivagem ou um maior grau de fragmentação. Um do grandes objetivos das pesquisas tem se focalizado na diminuição destes efeito, pela formulação de novos sistemas de cultura e metodologia, nas quais o AH poderia ter um importante papel.
A implementação do AH tem se demonstrado eficaz em pacientes nas quais alterações químicas ou físicas na ZP ocorreram como possível consequência da idade reprodutiva avançada ou altas concentrações de FSH (Schoolcraft et al. 1994).
Entretanto, há uma notável variação nos resultados relatados por diferentes laboratórios seguidos ao AH, incluindo grupos que não observaram vantagens após a implementação desta técnica (Bider et al., 1997). Isto poderia ser atribuído ao procedimento técnico empregado, o estágio de desenvolvimento no qual o AH é realizado ou o critério de seleção do embrião.
No que se refere a utilização do AH em casos com bom prognóstico, ou seja, pacientes jovens e sem falha de implantação as contradições permanecem. Hurst et al. (1998) avaliaram o papel do AH em pacientes com bom prognóstico para FIV num estudo prospectivo e randomizado e obtiveram 23% (3/13) de gravidez no grupo com AH comparado com 43% (3/7) no grupo controle e concluem que o AH não possui efeito benéfico nesta população.
Por outro lado, Széll, A.Z. et al. (1998) observaram uma melhor taxa de gestação (p<0.01) em pacientes com idade < 35 anos que realizaram AH 60% (9/19) do que aquelas pacientes na mesma faixa etária sem o AH 33% (5/15).
No presente estudo, observamos maiores taxas de implantação e gestação no grupo com AH em comparação ao grupo controle, apesar destas diferenças não serem significantes.
Em conclusão, o AH melhorou as taxas de implantação e gravidez em pacientes com idade2 37 anos e sem falhas anteriores de implantação, entretanto mais casos devem ser avaliados para a confirmação dessas hipóteses.