JBRA Assist. Reprod. 1998;02(03):35-39
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1998.2.3.05
“Assisted hatching” com o uso do laser: Uma nova abordagem para embriões criopreservados
Assisted hatching with laser: a new approach for cryopreserved embryos
*Professor de Tocoginecologia do Curso de Ciências Médicas da Universidade de Ribeirão Preto (UNAERP)
Resumo
Introdução: As taxas de implantação e gestação após a transferência de embriões criopreservados são usualmente inferiores as obtidas após a transferência de embriões a fresco. O objetivo do estudo foi avaliar as taxas de implantação e gestação após o uso do laser para o “Assisted Hatching” (AH) em embriões criopreservados após ICSI.
Material e Métodos: Um total de 48 pacientes apresentou embriões descongelados no período de abril a agosto de 1998 e pelo menos 1 embrião clivou após descongelamento e cultura por 24 horas. Para o procedimento de AH utilizou-se um diodo laser com comprimento de onda de 1.48μm (Fertilaser). Uma única abertura de aproximadamente 15μm foi realizada na zona pelúcida no momento da transferência dos embriões.
Resultados: A idade das pacientes foi de 31.75 ± 4.43 anos, o número médio de embriões descongelados foi de 6.62 ± 3.60. A sobrevida dos embriões foi de 76.44 ± 26.58%, sendo o número de embriões transferidos de 3.4 ± 1.36. A espessura média da zona pelúcida na população dos embriões descongelados (18.17±2.21 μm) foi significativamente maior (p= 0.02) que a espessura média (16.5±1.4 μm) do grupo controle (idade < 31±3.6, sem falha de implantação). A taxa de implantação embrionária foi de 8% (13/163), a taxa de de gravidez por transferência foi de 22.9% (11/48) e a taxa de aborto de 9.09% (1/11).
Conclusões: A espessura da zona pelúcida de embriões criopreservados está aumentada. As taxas de implantação embrionária e de gestação obtidas após o AH com laser poderia apresentar benefícios num programa de criopreservação.
Unitermos: criopreservação, embrião, laser, “assisted hatching”
Abstract
Introduction: The implantation and pregnancy rates obtained after the transfer of cryopreserved embryos are usually lower than those obtained after the transfer of fresh embryos. The objective of the present study was to determine the rates of implantation and pregnancy after the use of laser for “Assisted Hatching” (AH) in cryopreserved embryos after ICSI.
Material and methods: A total of 48 patients presented thawed embryos from April to October 1998 and at least 1 embryo cleaved after thawing and culture for 24 hours. A laser diode with 1.48 μm wavelength (Fertilaser) was used for the AH procedure. A single opening of about 15 μm was made in the zonapellucida at the time of embryo transfer.
Results: Patient age was 31.75±4.43 years and the mean number of thawed embryos was 6.62 ± 3.60. Embryo survival was 76.44 ± 26.58%, and the number of transferred embryos was 3.4 ± 1.36. The mean thickness of the zona pellucida in the population of thawed embryos (18.17±2.21 μm) was significantly greater (p=0.02) than the mean thickness (16.5±1.4 μm) of the control group (age: 31±3.6 years, with no failure implantation). The rate of embryo implantation was 8% (13/163), the pregnancy rate per transfer was 22.9% (11/48) and the abortion rate was 9.09% (1/11).
Discussion: The thickness of the zona pellucida of cryopreserved embryos is increased. The embryo implantation and pregnancy rates obtained after AH with laser may present benefits in a cryopreservation program.
Keywords: cryopreservation, embryo, laser, assisted hatching
Introdução
As taxas de implantação e gestação após a transferência de embriões criopreservados são usualmente inferiores as obtidas após a transferência de embriões a fresco.
Cohen et al. (1990) tem demonstrado que a redução nas taxas de implantação num programa de fertilização “in vitro” e transferência de embriões (FIV-TE) podem ser devido a inabilidade do embrião de sair (hatching) da zona pelúcida (ZP). Esta dificuldade do embrião realizar o processo de “hatching”, pode ser ocasionada pelo tempo em cultura em ambiente artificial que causaria um endurecimento da ZP, ou interferindo no mecanismo endógeno de “hatching” do bastocisto (Aikami e Cohen, 1992). O endurecimento da ZP em embriões criopreservados pode ser exacerbado pelo processo de congelamento/descongelamento (Tucker et al., 1991).
O objetivo deste estudo foi avaliar as taxas de implantação e gestação após o uso do laser para o “assisted hatching” (AH) em embriões congelados/descongelados provenientes de ICSI.
Material e Métodos
Esse estudo foi realizado em 48 pacientes que foram submetidas ao procedimento de ICSI e tiveram seus embriões supranumerários congelados e descongelados durante o período de abril 1998 até outubro 1998. Na estimulação ovariana prévia ao procedimento de ICSI, utilizou-se um bloqueio de 2ª fase com acetato de leuprolide na dose de 0.5 mg por dia (Lupron, Abbott). Habitualmente, 14 dias após o uso do análogo e estabelecido o bloqueio, iniciou-se o uso do FSH altamente purificado (Metrodin-HP, Serono) na dose fixa de 150UI a 225 UI pelo período de 7 dias. No oitavo dia da estimulação ovariana, teve início a monitorização do desenvolvimento folicular somente por ultra-som vaginal, sendo as doses de FSH puro adaptadas com a resposta ovariana, quando foram observados um mínimo de 3 folículos com diâmetro ≥ 17 mm, a gonadotrofina coriônica humana (HCG) foi administrado na dose de 10.000 UI.
Os oócitos foram coletados dos folículos através de punção transvaginal guiado por ultra-som, 34-36 horas após HCG. Após identificação no fluido folicular, os oócitos foram classificados pela maturidade. O complexo cumulus-corona foi removido pela exposição em solução de hialuronidase tipo IV (H-4272, Sigma Chemical Co., USA) na concentração de 80 UI/ml. Os oócitos desnudados foram incubados em meio IVF-50 (Scandinavian IVF Science AB, Sweden) até o momento do ICSI.
Na separação dos espermatozóides do fluido seminal foi usado gradientes descontínuos de Sperm-Prep-100TM (Scandinavian IVF Science AB, Sweden), nas frações 40% e 90%.
A ICSI foi performada em um microscópio invertido Olympus IMT-2 equipado com sistema de lentes Hoffman, e acoplado com um micromanipulador automático e injetores.
Uma solução de 10% polivinilpirrolidina (PVP-ICSI-100, Scandinavian IVF Science AB, Sweden) diluída em IVF-50 foi usada para imobilizar os espermatozóides. A solução viscosa de PVP é produzida especialmente para o procedimento de ICSI, e testada previamente para a presença de DNA e endotoxinas (Svalander et al., 1995).
O primeiro corpúsculo polar foi posicionado às 6:00 horas, e a micropipeta com espermatozóide, introduzida horizontalmente na posição de 3:00 horas dentro do ooplasma. Gentil sucção é aplicada cuidadosamente para quebrar o oolema e evidenciar a presença de ooplasma dentro da micropipeta, confirmando a deposição intracitoplasmática do espermatozóide. O espermatozóide imobilizado é inserido junto com o ooplasma aspirado, com um mínimo volume possível de PVP (Svalander et al., 1995). Os oócitos são observados 16 a 18 horas do procedimento para determinar a presença ou ausência de pronúcleos. O processo de fertilização normal é definido pela formação de dois pronúcleos distintos, seguido pelo aparecimento de clivagem embrionária após 24 horas da fertilização. Os embriões são rotineiramente transferidos após 48 horas em cultura e os embriões supranumerários são criopreservados no final do segundo dia.
Foram utilizados duas técnicas no processo de congelamento/descongelamento: I- método ultra-rápido (30 pacientes) e II - método lento (18 pacientes).
I - Método ultra-rápido
A- Congelamento dos embriões
No método de congelamento ultra-rápido utilizou-se 3.0 M DMSO (Sigma, D-2650) e 0.25 M sucrose (Sigma, S-1888) (Trounson et al., 1987) mas modificou-se o processo de descongelamento.Inicialmente, foram preparadas duas soluções: I - solução de cultura (SC), composta de meio IVF-50 mais 20% do soro inativado da paciente, e II - solução de DMSO, constituída de 3.935 ml de solução de cultura (SC) e DMSO 14.079 M no volume de 1.065 ml. Em seguida, preparou-se a solução de congelamento (SCo) onde uma concentração de sucrose (0.4278 g) foi adicionada ao volume final de 5.0 ml de solução DMSO. A SCo possui 3.0 M de DMSO e 0.25 M de sucrose, foi filtrada através de membrana 0.22 μm, gaseificada com mistura de 90% N2, 5% CO2 e 5% O2 e mantida à 4°C por no mínimo 12 he no máximo de 72 h. No procedimento de congelamento, os embriões são transferidos da SC à temperatura de 37°C para a SCo em temperatura ambiente, introduzidos em “paillettes” identificadas, as quais são seladas numa extremidade por algodão embebido pela SCo. Os embriões ficam em contato com a SCo em temperatura ambiente por período de 2.5 minutos, sendo em seguida mergulhados em recipientes contendo nitrogênio líquido (N2L) ‘a temperatura de −196°C. Não ocorreu estouro ou rompimento das “paillettes” com perda de embriões quando uma das extremidades foi deixada aberta.
B - Descongelamento dos embriões
No procedimento de descongelamento, prepara-se uma solução de descongelamento (SD) com 0.4278g de sucrose a qual é diluída com SC para um volume final de 5.0 ml, no dia do descongelamento. A SD (0.25M de sucrose) foi diluída em três diferentes concentrações: SD1 constituída de SD na proporção de 2 (SD): 1 (SC) (solução final de sucrose de 0.166M); SD2 constituída de SD na proporção de 1 (DS): 1 (SC) (solução final de sucrose de 0.125 M) e SD3 constituída de SD na proporção de 1 (DS): 2 (SC) (solução final de sucrose de 0.083 M). As soluções obtidas são colocadas em placas de cultura de Nunc, filtradas através de membrana com 0,22 μm, gaseificada com mistura N2 90%, CO2 5% e O2 5% e mantida na temperatura ambiente.Assim sendo, as “paillettes” contendo embriões congelados são retiradas do N2L, deixadas por 30 segundos em temperatura ambiente, mergulhadas em banho-maria à 30°C por 40 segundos, (mantendo-se a extremidade não selada fora do contato com a àgua) sendo os embriões transferidos consecutivamente para as 3 etapas de diluições de sucrose (SD1, SD2 e SD3) pelo período de dez minutos em cada solução à temperatura ambiente. Após este período, os embriões são colocados em SC à temperatura ambiente por 5 minutos, e em seguida em microgotas de SC cobertas por óleo à temperatura de 37°C, e mantidos em atmosfera de C02 5%, por período mínimo de 24h. Por último, os embriões são analisados separadamente quanto ao desenvolvimento embrionário, e apenas, aqueles que apresentaram continuação do processo de clivagem embrionária foram transferidos para a paciente (Van der Elst et al., 1997).
II- Método lento (Programa - 0 Criologic CL-863)
Á - Método de congelamento
1- Retirar o “freeze-kit 1” (Scandinavian IVF Science AB -ref: 6120) composto por: PBS, S-1 (1.5 M Propanodiol (PROH)) e S-2 (1.5 M de PROH + 0.1 M Sucrose) da geladeira e deixar estabilizar em temperatura ambiente, no mínimo 15 minutos.
2- Distribuir as soluções (PBS, S-1 e S-2) em placa de cultura de Nunc.
3- Estabilizar a criocâmara no nitrogênio líquido por 5 minutos, e deixar o programa estabilizar por 10 minutos.
4- Embriões são colocados em solução de PBS, por curto período.
5- Transferir os embriões para a S-1 por 10 minutos. Durante este período realizar a lavagem das “paillettes” (0.25 ml) na S-2.
6- Transferir os embriões para a S-2, rapidamente e realizar o preenchimento das “paillettes”, com o auxílio de seringa de tuberculina.
7- As “paillettes” são colocadas na câmara de congelamento equilibrada a 24°C, no programa 0.
8- Realizar o “seeding” (aproximadamente 17 minutos do início do programa) manualmente à −6.0°C.Obs.: O recipiente contendo nitrogênio líquido (N2L) deve ser mantido fechado, recolocar N2L no momento do “seeding” e após em intervalos de 35-40 min.
9- Deixar o programa correr em queda livre até −150° C, após transferir as : paillettes: para o N2L.
B - Método de descongelamento
1- Retirar o “thaw-kit 1” (Scandinavian IVF Science AB - ref: 6130) composto por: S-1 (1.0 M de PROH + 0.2 M Sucrose), S-2 (0.5 M de PROH + 0.2 M de Sucrose), S −3 (0.2 M de Sucrose) e PBS.A clivagem embrionária após 24 horas de cultura foi considerada presente quando se observou a divisão de pelo menos um dos blastômeros (Lai et al., 1996). Dois esquemas hormonais foram utilizados para a transferência dos embriões descongelados: ciclo natural e ciclo substitutivo. No ciclo natural, o controle do desenvolvimento folicular é realizado por ultra-sonografia vaginal seriada a partir do 10° dia do ciclo. Uma dose de 5.000 UI HCG é administrada quando o folículo apresenta diâmetro ≥ 18mm, sendo rotineiramente o descongelamento realizado no 4° dia após o HCG (dia da injeção do HCG = dia nº 1) e a transferência embrionária no 5° dia após o HCG.
2- Distribuir as soluções em placa de cultura de Nunc, deixar estabilizar em temperatura ambiente, no mínimo 15 minutos.
3- Remover as paillettes do N2L e deixar ‘a temperatura ambiente por 30 segundos.
4- Transferir para banho-maria (30°C) por 40 segundos.
5- Enxugar cuidadosamente as “paillettes”, cortar as extremidades, acoplar a seringa de 1ml e expelir o conteúdo desta na S-1 pré estabilizada , por 5 minutos.
6- Transferir para a S-2 por 5 minutos.
7- Transferir para S-3 por 10 minutos.
8- Transferir para PBS sem soro por 5 minutos.
9- Transferir para novo PBS estabilizado a C02 5%/37°C, por 5 minutos.
10- Finalmente transferir para Solução de IVF-50 + 20% soro sintético substutivo (Irvine) pré estabilzado (C02 5%/ 37°C).
11- Transferência será realizada após 24 hrs do descongelamento após a verificação da clivagem embrionária.
No ciclo substitutivo, administra-se do 1° ao 13° dia do ciclo, valerianato de estradiol (VE) na dose diária de 4 a 6 mg. A progesterona é introduzida no 14° dia, via intramuscular, na dose de 50mg/dia, desde que a espessura endometrial seja superior a 6 mm . O descongelamento é realizado após 4 dias do uso de progesterona e a transferência no 5° dia de progesterona.
Procedimento de “assisted hatching”
O AH foi realizado com um diodo laser (Fertilaser-MTM, Medical Tecnologies Montreux -Switzerland) com comprimento de onda de 1.48 μm o qual opera através de um objetiva acoplada em microscópio invertido Eclipse TE300.
No momento da transferência, os embriões foram colocados em grupos de 1 a 4 em placas Nunc contendo meio de cultura (IVF). Em seguida, utilizando a platina do microscópio, sem utilizar micromanipuladores para a fixação do embrião, o embrião foi posicionado no campo óptico e a ZP focada em direção a luz do laser. O afinamento da ZP foi então realizado com uma única irradiação de 10 ms, suficiente para afinar a ZP em ~ 15 μm (Figura I).
Fig. I. Abertura da zona pelúcida com laser
A espessura da ZP foi medida através de uma escala presente na ocular do microscópio.
Após a realização do procedimento de “hatching”, os embriões foram transferidos para novo meio de cultura, a fim de evitar possível toxicidade dos produtos derivados da ação do laser nos componentes orgânicos da ZP,
A transferência embrionária foi realizada imediatamente após o procedimento.
Resultados
A idade das pacientes foi de 31.75 ± 4.43 anos, o número médio de embriões descongelados foi de 6.62 ± 3.60. A sobrevida dos embriões foi de 76.44 ± 26.58%, sendo o número de embriões transferidos de 3.40 ± 1.36. A média da espessura da ZP dos embriões transferidos foi de 18.17 ± 2.21 μm. A taxa de implantação embrionária foi de 7.97% (13/163), a taxa de de gravidez por transferência foi de 22.91% (11/48) e a taxa de aborto de 9.09% (1/11).
Discussão
As condições de cultura e/ou das técnicas de criopreservação poderiam afetar a ZP o que interferiria com o processo natural do “hatching” do blastocisto. A abertura da ZP destes embriões antes da transferência poderia facilitar o processo de implantação.
Check et al. (1996) num estudo pareado com setenta e nove mulheres que receberam embriões congelados/descongelados obtiveram doze (15.2%) gestações clínicas por transferência no grupo controle (sem AH) versus 24 (30.4%) no grupo com AH e concluem que o AH não possui efeito deletério aos embriões e que poderia melhorar as taxas de implantação embrionária.
Na mesma linha de raciocínio, Tucker et al. (1991) realizaram o AH em embriões congelados/descongelados em 32 ciclos e obtiveram uma taxa de implantação de 16% (10/63), sendo que em 33 ciclos que serviram de controle a taxa de implantação foi de 9% (6/64). Os autores concluem que os grupos deveriam ter o dobro de casos para que esta diferença fosse significativa do ponto de vista estatístico.
No presente estudo, a média da espessura da ZP dos embriões foi de 18.17 ± 2.21 μm, o que se mostrou significantemente maior (p=0.02) do que a espessura média (16.5 ± 1.4 μm) da ZP de um grupo controle (idade 31 ± 3.6 anos, sem falha anterior de implantação), demonstrando que o processo de congelamento/ descongelamento pode acarretar um espessamento da ZP.
Por outro lado, as taxas de implantação embrionária (7.9%) e de gestação (22.9%) obtidas após o AH com laser demonstram que esta tecnologia não apresenta efeitos deletérios aos embriões humanos congelados/descongelados e podem apresentar benefício nos resultados de um programa de criopreservação