JBRA Assist. Reprod. 1999;03(01):9-13
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1999.3.1.03
Resumo
Introdução: Novos métodos de fertilização assistida têm dado grande alento a casais que procuram clínicas especializadas no tratamento da infertilidade. Os bancos de sêmen tem que criopreservar espermatozóides e na maior parte das vezes, após o descongelamento, ocorre uma perda significativa de motilidade associada a alterações estruturais e funcionais que levam a queda na qualidade do sêmen e diminuição nas taxas de sucesso de fertilização. Nosso objetivo é avaliar o meio ideal de criopreservação para espermatozóides humanos baseados numa análise temporal e de qualidade de sêmen, comparando o glicerol com o tampão contendo gema de ovo.
Material e Métodos: Sêmen de dez doadores voluntários saudáveis do banco de sêmen da Cleveland Clinic Foundation foram colhidos por masturbação após dois dias de abstinência sexual. Feita a contagem total dos espermatozóides, as amostras foram divididas em alíquotas iguais, sendo que metade delas foi criopreservada e estocada com glicerol e a outra metade com o TYB (tampão contendo gema de ovo - Test-yolk Buffer, Irvine Scientific, Santa Ana, Califória, EUA). Analisadas a 0, 60, 120 e 180 minutos após descongelamento, os dados foram coletados quanto a morfologia (critério de Kruger e método da OMS), motilidade, edema hiposmolar e penetração em muco cervical bovino. Através da técnica de coloração da eosina-nigrosina foi estudada a viabilidade do sêmen. Os resultados foram analisados estatisticamente.
Resultados: A motilidade percentualmente diminuiu significativamente nas amostras pós-descongelamento comparando-se com os valores de pré-congelamento em ambos os meios. A motilidade pós-aquecimento foi maior no espécime do TYB quando comparado com o glicerol (p=0,0035). O espécime do TYB também apresentou maior motilidade até mais que 180 minutos (medidas a cada hora) comparado com o glicerol (p=0,013). O percentual de viabilidade foi significativamente maior com o TYB quando comparado com o glicerol (p<0,02). A morfologia do esperma classificada pelos métodos de Kruger e da OMS diminuíram significativamente nos espécimes reaquecidos independentemente do meio usado em relação aos valores pré-congelamento (p=0,003).
Conclusão: A motilidade dos espermatozóides diminui menos com o tempo nos casos onde foi usado o TYB para a criopreservação quando comparados com o glicerol. Também a viabilidade dos mesmos e as características morfológicas e funcionais apresentaramse melhores nesses casos. Verificamos que o TYB mostrou-se melhor que o glicerol, e recomendamos o seu uso para a criopreservação de sêmen humano.
Unitermos: espermatozóide, criopreservação, fertilização
Abstract
Introduction:Techniques of assisted fertilization are giving new hope for couples who search for clinics specialized in artificial fertilization. Semen samples must be cryopreserved and most of the time, after unfreezing, there is a significant loss in motility associated to functional and structural defects who lead to bad semen quality and lessened fertilization rates. Our aim is to evaluate the best cryopreservation media for human spermatozoa based in a temporal analysis of semen quality comparing glycerol to Test-yolk Buffer (TYB).
Material and Methods: Semen samples were obtained from 10 healthy volunteer individuais of the Cleveland Clinic Foundation Sperm bank. The ejaculates were collected after two days of sexual abstinence. Samples were divided in two equal aliquotes which were cryopreserved with glycerol or with Test-yolk Buffer (Test-yolk Buffer, Irvine Scientific, Santa Ana, Califoria - TYB). Sperm samples were analised at 0, 60, 120, 180 minutes after unfreezing and data was collected for morphology, motility, cellular swelling and cervical mucus penetration. Sperm viability was assessed by eosin-nigrosin staining and the results were statistically analised.
Results: Both media used for cryopreservation led to significant loss in semen motility and viability. TYB was superior to glycerol as a criopreserving media due to better results regarding sperm motility and viability. All samples showed abnormal sperm morphology, independently of the used media.
Conclusions: Samples cryopreserved with TYB had sperm motility less diminished when compared to samples where glycerol was the used media. The results were the same when regarded sperm viability and morphological and functional characteristics. We verified that TYB was better than glycerol for cryopreservation and we recomend its use for human semen storage.
Keywords: spermatozoa, cryopreservation, fertilization
Introdução
O sucesso na criopreservação de espermatozóides de mamíferos começou a ter grande repercussão após as observações de Polge et al. (1949), mostrando que o glicerol tem interessantes e peculiares propriedades como meio de criopreservação. A técnica do vapor de nitrogênio líquido introduzida por Sherman no início dos anos 60 ainda continua a ser muito empregada (Sherman, 1963). O congelamento com velocidade lenta e controlada torou-se o método de escolha para a criopreservação do sêmen e permitiu uma taxa de resfriamento reprodutível levando a uma igual, efetiva e uniforme desidratação celular, prevenindo a formação de cristais intracelulares.
Entretanto, a criopreservação do sêmen humano resultou em uma motilidade diminuída, lesões estruturais como a perda do acrossomo e diminuição “in vitro” da penetração da zona pelúcida do ovo de hamster. Essa habilidade representa o mais importante parâmetro de avaliação do potencial de fertilização do espermatozóide criopreservado (Centola et al., 1992). A escolha do meio de criopreservação para o sêmen deveria ser dirigida para a melhoria da capacidade de manter a integração e função celular durante o processo de congelamento e descongelamento.
Sabe-se que a capacidade de fertilização do esperma fresco é muito maior do que a do congelado, e isto pode ocorrer devido ao inadequado meio de criopreservação que causa danos celulares atribuíveis ao glicerol.
Do ponto de vista clínico é aceitável assumir que uma taxa de gravidez cumulativa usando-se espermatozóides congelados é comparada ao uso de sêmen fresco, mas as taxas de fecundidade por ciclo para sêmen fresco e congelado são diferentes. Assim, a inseminação artificial com espermatozóides descongelados tem uma taxa de gravidez reduzida, que varia de 5 a 20% por ciclo (Richter et al., 1984; Wo ng et al., 1989; Steinberger et al., 1973; Centola et al., 1990).
Os meios de criopreservação convencional de sêmen humano são baseados no uso do glicerol como principal crioprotetor permeável na presença ou ausência de protetores celulares como soluções tampão de citrato, Tes-Tris ou Hepes, geralmente na presença de macromoléculas não permeáveis como ovo ou albumina, com uma concentração final de glicerol entre 5 e 10% para melhores resultados. Normalmente, os protocolos incluem adição direta de glicerol e dos protetores como Tes-Tris e gema de ovo tamponados na razão de 1:1 com o sêmen (Wolf et al., 1989). A eficácia dos agentes crioprotetores pode ser medida comparando-se os parâmetros pré-congelamento com os pós-descongelamento, como a motilidade. Entretanto estas avaliações não levam em consideração os danos adquiridos à membrana da célula durante o processo de criopreservação nem a inativação da reação acrossomal. Também resultam na perda ou inativação da acrosina, uma importante enzima para a fertilização. Além disso, a motilidade do espermatozóide pode perder sua habilidade de atingir sua capacitação máxima e sofrer reação acrossomal ou mesmo perder alguns mecanismos complexos de ativação do oócito durante o processo de fertilização. Um maior número percentual de espermatozóides com acrossomo ativado está presentes em amostras incubadas com o Test-yolk-buffer (TYB) quando comparadas a controles e tem sido sugerido que isso também pode produzir um grupo grande de espermatozóides capacitados e com reação acrossomal possível para melhores resultados de fertilização.
O efeito favorável da interação espermatozóide-oócito no TYB pode ser atribuído á preservação da membrana dos gametas em condição apropriada de pH, conservação a frio e baixa atividade metabólica. Entretanto, o TYB tem como principal característica a superioridade como meio de conservação a frio, não havendo evidência de aumento na capacidade de fertilização ou melhores resultados na morfologia após descongelamento quando comparados ao glicerol (Veeck, 1992). A conservação prolongada e o descongelamento lento (4ºC a 37ºC) podem ser parcialmente responsáveis pelo aumento na população de espermatozóides capacitados, com acrossomo ativo e funcionalmente viáveis (Jonhson et al., 1985). A proposta desse estudo foi comparar o efeito dos criopreservantes nas mudanças funcionais e morfológicas do espenatozóide em tempos padrões de pós-aquecimento com referência especial à lesões de membranas e critérios estritos de morfologia.
Material e Métodos
As amostras de sêmen obtidas por masturbação de dez doadores saudáveis que participavam do banco de espenna do laboratório de Andrologia na Cleveland Clinic Foundation após dois a três dias de abstinência sexual. A criopreservação do sêmen foi executada após a liquefação de cada amostra, sendo dividida em duas alíquotas iguais. Cada alíquota foi criopreservada somente com glicerol (6% com o ej aculado) ou com o TYB pela técnica de congelamento pelo vapor de nitrogênio líquido. Uma amostra de 5ml do meio congelado foi aquecida a 37ºC. Uma alíquota do meio congelado igual a 25% do volume do espécime original foi então adicionada ao espécime, com o qual foi misturado durante cinco minutos usando o Hema-Tek. Este passo foi repetido até obtenção de mistura com iguais proporções de ejaculado e meio de preservação. A mistura foi então dividida em alíquotas iguais para longo tempo de estocagem. Uma amostra adicional foi criopreservada para obtenção de sobrevivência em 24 horas. As amostras de criopreservados foram colocadas em fr eezer a -20ºC por 8 minutos e então mergulhadas em vapor de nitrogênio líquido por duas horas e finalmente colocadas em nitrogênio líquido (-196ºC) para longa estocagem. As amostras de criopreservados foram reaquecidos a 37ºC para avaliação da motilidade pós-aquecimento e o meio de criopreservação foi removido e a amostra lavada com fluido tubário humano modificado.
As amostras de sêmen foram analisadas num computador com análise de movimento antes do congelamento e aos 0, 60, 120 e 180 minutos após o descongelamento e lavagem com HTF modificado. Para cada medida uma amostra de 5μl de cada um dos meios crioprotetores foi colocado numa lâmina.
A contagem de espermatozóides totais pré-congelamento e pós-descongelamento, percentual de motilidade, morfologia (método de Kruger e método da OMS) e o edema hiposmolar, penetração no muco cervical bovino e teste de viabilidade usando a técnica de coloração da eosina-nigrosina foram avaliados. Todos os parâmetros foram avaliados aos 0, 60, 120 e 180 minutos após descongelamento, e os resultados da análise do sêmen (concentração e motilidade), foram verificados manualmente.
Análise estatística: O teste T-Student pareado e um teste de “signed rank” foram usados para analisar a mudança nas percentagens de características de motilidade. O valor p<0,05 foi considerado significativo. As amostras do sêmen em cada grupo foram estudadas individualmente para evitar possíveis interações entre o “pool” das amostras. O resultado foi relatado como a média mais ou menos um desvio padrão. Um software de estatística foi usado para analisar os dados.
Resultados
A concentração média de espermatozóides vai de 60,4 ± 37 106 / ml e a motilidade foi de 46,8 ± 26,7%. O percentual de motilidade reduziu significativamente na amostra pós-descongelamento comparada com os valores pré-congelamento em ambos os meios. A motilidade pós-descongelamento foi maior no TYB comparado com o glicerol (17,2% ± 18,7% versus 10,2% ± 15,5%; p= 0,0035). Os espécimes do TYB também apresentaram maior motilidade em tempo superior a 180 minutos (medindo a cada 60 minutos) comparado com o glicerol e foram 10,4 ± 9,1 % e 7,8 ± 10,7% (p= 0,013) aos 180 minutos. A percentagem de viabilidade foi significativamente maior com TYB, quando comparado com o glicerol (8,7% ± 8,6% versus 5,7% ± 5,9%; p < 0,02). A morfologia dos espenatozóides, classificada pelos critérios de Kruger e da OMS, reduziu significativamente nas amostras congeladas pós-aquecimento com o mesmo meio, comparada com os valores pré-congelamento (p <0,003). Comparando a morfologia pré-congelamento e pós-descongelamento pelo método da OMS mostrou-se que TYB preserva melhor a morfologia (p < 0,005). Os valores do teste do muco cervical bovino foram significativamente menores nos espécimes preservados no glicerol (13,8±10,2 versus 9,0±8,3 p< 0,005). O teste de edema hipo-osmolar pós-aquecimento não mostrou diferença significativa dos valores pré-congelamento em nenhum dos meios empregados (95,8% ± 1,9; 90,0% ± 19,1; 94.9% ± 4,2; p=0,36).
Discussão
É de conhecimento geral que o sistema tampão (TESTY) contendo N-tris (hidroximetil) ácido sulfônico metil - 2 amino etano (TES) e TRIS (hidroximetil) amino metano e gema de ovo aquecido e tratado é uma solução levemente hiperosmolar feita de dextrose e antibióticos, e pode ser usada por longo tempo em baixa temperatura para estocagem de espermatozóides. Além do mais, o uso da gema de ovo como crioprotetor introduz uma nova variável na fonte protéica (Graham et al., 1978). O TES é largamente utilizado em tampões devido as taxas de tamponamento e compatibilidade com muitas enzimas. Para fazer o TYB são usados 20% de gema de ovos de galinha (livres de vírus e inativados pelo calor) adicionados ao tampão e a solução combinada é então centrifugada. O uso na criopreservação do sêmen é bem estabalecido em procedimentos em bancos de sêmen, na maioria porque é superior na recuperação de motilidade dos espermatozóides (Rangi et al., 1993). Também aumenta o processo de capacitação e penetração em oócitos de hamster (Smith et al., 1987; Holmgren et al., 1989). O potencial de fertilização dos espermatozóides criopreservados pode ser avaliado pela sua habilidade em penetrar o oócito de hamster in vitro. A criopreservação na presença do TESTY resulta no aumento da estabilidade do sistema acrosina - pró-acrosina quando os espermatozóides são preservados em glicerol (2-3 x mais pró-acrosina são mantidas). Alguns autores mostraram uma capacidade de penetração reduzida no oócito humano usando o teste de penetração da zona livre do ovo de hamster, após a criopreservação feita usando-se o glicerol como meio protetor. Parece que os espermatozóides tomam-se dependentes do glicerol e a refoção deste meio que o envolve causa enorme redução na capacidade de penetração.
Este resultado indica que o glicerol sozinho não é um bom meio para criopreservação de espermatozóides humanos (Jeyedran et al., 1984). Também a capacitação e a reação acrossômica são assincrônicas em diferentes amostras de sêmen do mesmo indivíduo. Ficou evidente que o espermatozóide tem um tempo de vida prolongado usando-se o TYB. Além disso aumenta a viabilidade do espermatozóide e no final uma sincronização de uma população de espermatozóides assíncronos, e dessa forma ter a máxima quantidade de espermatozóides potencialmente capacitados para a penetração do oócito. O TYB mostrou ajudar na avaliação do potencial de fertilização e aumentar diretamente o sucesso da fertilização in vitro. Foi demonstrado que o TYB influenciou positivamente o potencial de fertilização de alguns pacientes em um programa de fertilização in vitro após duas horas de incubação dos espermatozóides (Katayama et al., 1989). Recentemente, anticorpos antiespermatozóide mostraram reduzir a fertilidade através de numerosos mecanismos entre os quais inibição da penetração dos espermatozóides no muco cervical, redução da ligação do espermatozóide à zona pelúcida humana, diminuição da zona de penetração, redução na fusão espermatozóide-oócito, fagocitose através de opsonização dos espermatozóides. Além disso, pode também reduzir a clivagem do zigoto, implantação e sobrevivência do embrião. Recentemente, evidenciou-se que o TYB não tem efeito na ligação dos anticorpos antiespermatozóides pelo teste de imunoligação no sêmen fresco (Hensleigh et al., 1996; Katsoff et al., 1994).
Entretanto foi feita a hipótese de que o TYB pode alterar a configuração da membrana do espermatozóide, permitindo que os anticorpos antiespermatozóides sejam liberados da membrana, diminuindo a percentagem de imunoglobulinas classe A (IgA) e Ig G anticorpos antiespermatozóide. Estes achados foram confirmados por outros, com significativa redução nos níveis de anticorpos no sêmen após tratamento com TYB.