JBRA Assist. Reprod. 1999;03(01):20-26
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1999.3.1.05
Uma comparação randomizada da criopreservação de embriões humanos obtidos após injeção intracitoplasmática de espermatozóide com o método lento ou ultrarápido de congelamento
A randomized comparison of the cryopreservation of human embryos obtained after intracytoplasmic sperm injection with a slow cooling or ultrarapid cooling procedure
*Professor de Tocoginecologia do Curso de Ciências Médicas da Universidade de Ribeirão Preto (UNAERP)
Resumo
Introdução: A finalidade deste trabalho foi comparar um método ultra-rápido (MUR) modificado com dimethyl-sulphoxide (DMSO) versus método lento (ML) com propanediol (PROH) na criopreservação de embriões humanos excedentes de um programa de injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI).
Material e Métodos: Um total of 170 ciclos foram criopreservados e 80 ciclos foram descongelados, sendo 44 descongelamentos no grupo A (método ultra-rápido - modificado (DMSO 3M / 0.25 M sucrose / descongelamento em 3 gradientes de sucrose) e 36 no grupo B (método lento - (propanediol 1.5M / programa 0 - Criologic CL-863)).
Resultados: A faixa etária (grupo A = 31.4±4.5; grupo B = 32 ± 4.3) não diferiu entre os grupos (p=0.37). O número de embriões congelados (grupo A = 6.7 ± 3.2; grupo B = 6.5 ± 3.2) foi semelhante (p=0.76). Por outro lado, o número de embriões descongelados também foi igual (p=0.32) (grupo A = 7.1 ± 3.1 ; grupo B = 6.6 ± 3.3) entre os grupos. A taxa de sobrevida embrionária foi superior (p=0.02) no grupo B (79.8 ± 24.3%) do que no grupo A (65.3 ± 29.8%). A taxa de clivagem embrionária, também foi maior (p=0.001) no grupo B (55.4 ± 32.4%) quando comparada com o grupo A (23 ±21.1%). O número de embriões transferidos não diferiu (p=0.73) entre os grupos (grupo A=3.32 ± 1.33; grupo B=3.47 ± 1.08). A taxa de implantação embrionária entre os grupos (grupo A = 6.5%; grupo B = 12.6%) foi semelhante (p=0.12). A taxa de gravidez por descongelamento e por transferência embrionária foi superior no grupo B (33.3% e 37.5%, respectivamente) em comparação com o grupo A (13.6% e 16.2%, respectivamente), entretanto estas diferenças não foram significativas (p=0.058 e 0.34 respectivamente).
Conclusão: Os dados obtidos até momento sugerem que a criopreservação de embriões excedentes após ICSI com ML é superior (taxas de sobrevida e clivagem) ao MUR.
Unitermos: criopreservação, embrião humano, ICSI, método ultra-rápido, método lento
Abstract
Introduction: To compare an ultrarapid method (URM) modified with dimethyl-sulphoxide (DMSO) to a slow method (SM) with propanediol (PROH) for the cryopreservation of extra human embryos in a program of intracytoplasmic sperm injection (ICSI).
Material and Methods: The extra embryos of 170 patients were cryopreserved in a prospective and randomized manner (drawing lots) by a modified URM (Group A) (3 M DMSO/0.25 M sucrose/thawing in 3 sucrose gradients) or by SM (1.5 M propanediol / program O - Cryologic CL-863) (Group B). A total of 80 cycles have been thawed thus far. The number of thawed was 44 in group A and 36 in group B.
Results: The mean age ( group A = 31.4 ± 4.5; group B = 32 ± 4.3) did not differ between the groups (p=0.37). The number of frozen embryos (group A = 6.7 ± 3.2; group B = 6.5 ± 3.2) was similar (p=0.76). Also the number of thawed embryos was similar (p=0.32) for the two groups (group A = 7.1 ± 3.1 ; group B = 6.6 ± 3.3). Survival rate was superior (p=0.02) for group B (79.8 ± 24.3%) than for group A (65.3 ± 29.8%). Cleavage rate was also higher (p=0.001) for group B (55.4 ± 32.4%) compared with group A (23±21.1%). The number of transferred embryos did not differ (p=0.73) between the groups (group A=3.32 ± 1.33; group B=3.47 ± 1.08). Implantation rate between the groups (group A = 6.5%; group B = 12.6%) was similar (0.12). Pregnancy rates per thawed and transferred cycles was superior for group B (33.3% e 37.5%, respectively) compared with group A (13.6% e 16.2%, respectively). However , the differences were not significants (p=0.058 e 0.34 respectively).
Conclusion: The data obtained thus far suggest that the SM is superior to the URM for the cryopreservation of extra embryos after ICSI in terms of survival and cleavage.
Keywords: cryopreservation, human embryo, ICSI, ultrarapid method, slow cooling
Introdução
A vantagem de um programa de criopreservação para estocar embriões supranumerários obtidos após hiperestimulação pelas técnicas de reprodução assistida tem sido amplamente discutida na literatura. A criopreservação de embriões humanos teve um progresso desde o primeiro relato de Trounson e Mohr (1983), quando congelaram embriões com 3 células com dimethil-sulphoxido (DMSO).
Embriões humanos tem sido criopreservados no estágio de uma célula, estágio multicelular ou na estágio de blastocisto e podem ser criopreservados através de uma variedade de métodos envolvendo diferentes crioprotetores. Entretanto, a maioria desta técnicas de criopreservação baseadas em congelamento lento requerem equipamentos caros e consomem tempo.
O método ultra-rápido (MUR) requer somente uma breve exposição dos embriões ao crioprotetor em temperatura ambiente, seguido por imersão em nitrogênio líquido (N2L).
Trounson et al. (1987) relataram o uso do MUR para congelamento de embriões de camundongo, o que requer numa rápida exposição dos embriões (2 a 2.5 minutos) a uma alta concentração de DMSO (3 a 4 M) e a 0.25 M de sucrose, seguido pela imersão em N2L e rápido descongelamento em uma solução de 0.25 M de sucrose.
A aplicação do MUR em programas de fertilização “in vitro” (FIV) obtem taxas variáveis de gravidez (7.1% a 20%) por transferência de embriões (Barg et al., 1990; Feichtinger et al., 1991; Lai et al., 1996).
O desenvolvimento da técnica de injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) permitiu que muitos casais conseguissem obter fertilização, quando eles experimentaram ausência ou baixas taxas de fertilização utilizando o FIV convencional (Palermo et al., 1993). Existem muitas publicações demonstrando altas taxas de fertilização e gestações com o ICSI após transferências de embriões a fresco em vários centros ao redor do mundo. Entretanto, há pouca informação no que se refere ao efeito da criopreservação destes embriões (Hoover et al., 1997).
A grande parte dos estudos de criopreservação de embriões provenientes de ICSI utilizam o método lento (ML). Em 1994, Van Steirteghem et al. estudaram a eficácia da transferência de embriões humanos multicelular supranumerários obtidos após ICSI. Os embriões foram criopreservados no 2º ou 3º dia pelo ML com DMSO (Camus et al., 1989). Eles relataram um taxa de sobrevida de 53% e uma taxa geral de gravidez (β-hCG positivo) de 21.8% por transferência. A taxa de gravidez clínica foi de 12.9% e taxa de parto de 5.9%. A taxa de abortamento pré-clínico foi de 40.9%.
Em Al-Hasani et al., 1996, usando o ML com propanediol, concluiram que prónucleos obtidos do ICSI podem ser congelados/descongelados com sucesso e as taxas de gravidez (17%) conseguidas são comparaveis aquelas dos zigotos provenientes do FIV (20%). Em Hoover et al., 1997, usando o ML, observaram que pronúcleos resultantes de ICSI podem ser criopreservados e descongelados com taxas comparáveis (14%) as do FIV convencional (17.4%). Em Macas et al., 1988, relataram que os zigotos provenientes de ICSI sobrevivem à criopreservação em taxas similares aos zigotos de FIV, mas sua abilidade de implantar e desenvolver posteriormente estaria provalvemente afetada pelo procedimento de criopreservação.
Uma experiência clínica com a criopreservação de embrlões provenientes de ICSI pelo MUR foi relatada por nosso grupo (Mauri et al., 1998). Neste estudo, embriões de 42 ciclos foram descongelados e um total de 24 transferências foram realizadas (57.1% dos casos tinham pelo menos 1 embrião clivado após 24 horas). A taxa de gravidez clínica por ciclo de descongelamento foi de 16.6%. A taxa de gravidez clínica por transferência foi de 29.2% e de implantação de 13.2%. O objetivo do presente estudo foi comparar a criopreservação de embriões provenientes de ICSI pelo MUR com DMSO versus o ML com propanediol.
Material e Métodos
Um total de 170 ciclos de criopreservação de embriões provenientes de ICSI foram incluidos, destes foram avaliados 80 ciclos que tiveram seus embriões descongelados. Um total de 44 descongelamentos no grupo A (MUR) e 36 no grupo B (ML).
Na estimulação ovariana prévia ao procedimento de ICSI, utilizou-se um bloqueio de 2ª fase com acetato de leuprolide na dose de 0.5 mg por dia (Lupron, Abbott). Habitualmente, 14 dias após o uso do análogo e estabelecido o bloqueio, iniciou-se o uso de FSH puro (Metrodin-HP, Serono) ou FSH recombinante (Gonal F, Serono) na dose fixa de 150 ou 225 UI pelo período de 7 dias. No oitavo dia da estimulação ovariana, teve início a monitorização do desenvolvimento folicular somente por ultra-som vaginal, sendo as doses de FSH puro adaptadas com a resposta ovariana, quando o mínimo de 3 folículos com diámetro ≥ 17 mm foram observados, gonadotrofina coriônica humana (hCG) foi administrado na dose de 10.000 UI. Os oócitos foram coletados dos folículos através de punção transvaginal guiado por ultra-som, 34-36 horas após hCG. Após identificação no fluido folicular, os oócitos foram classificados pela maturidade. O complexo cúmulus-corona foi removido pela exposição em solução de hialuronidase type IV (H-4272, Sigma Chemical Co., USA) na concentração de 80 UI/ml. Os oócitos desnudados foram incubados em meio IVF-50 (Scandinavian IVF Science AB, Sweden) até o momento do ICSI.
Na separação dos espermatozóides do fluido seminal foi usado gradientes descontínuos de Sperm-Prep-100TM (Scandinavian IVF Science AB, Sweden), nas frações 40% e 90%.
O procedimento de ICSI foi realizado segundo metodologia descrita por Svalander et al. (1995). Os embriões são rotineiramente transferidos após 48 horas em cultura e os embriões excedentes são congelados no final do segundo dia.
I-Método ultra-rápido
A - Congelamento dos embriões
No método de congelamento ultra-rápido utilizou-se 3.0 M DMSO (Sigma, D-2650) e 0.25 M sucrose (Sigma, S-1888) (Trounson et al., 1987) mas modificou-se o processo de descongelamento.Inicialmente foram preparadas duas soluções : I - solução de cultura (SC), composta de meio IVF-50 mais 20% do soro inativado da paciente, e II - solução de DMSO, constituida o de 3.935 mi de solução de cultura(SC) e DMSO 14.079 M no volume de 1.065 ml. Em seguida preparou-se a solução de congelamento(SCo) onde uma concentração de sucrose (0.4278 g) foi adicionada ao volume final de 5.0 ml de solução DMSO . A SCo possui 3.0 M de DMSO e 0.25 M de sucrose, foi filtrada através de membrana 0.22 μm, gaseificada com mistura de 90% N2, 5% CO2 e 5% O2 e mantida à 4¡C por no mínimo 12 h e no máximo de 72 h. No procedimento de congelamento, os embriões são transferidos da SC à temperatura de 37¡C para a SCo em temperatura ambiente, introduzidos em “paillettes” identificadas, as quais são seladas numa extremidade por algodão embebido pela SCo. Os embriões ficam em contato com a SCo em temperatura ambiente por período de 2.5 minutos, sendo em seguida mergulhados em recipientes contendo nitrogênio líquido (N2L) à temperatura de -196¡C.
B- Descongelamento dos embriões
No procedimento de descongelamento, prepara-se uma solução de descongelamento (SD) com 0.4278g de sucrose a qual é diluída com SC para um volume final de 5.0 mi, no dia do descongelamento. A SD (0.25M de sucrose) foi diluída em três diferentes concentrações: SD1 constituída de SD na proporção de 2 (SD): 1 (SC) (solução final de sucrose de 0.166M); SD2 constituída de SD na proporção de 1 (SD): 1 (SC) (solução final de sucrose de 0.125 M) e SD3 constituída de SD na proporção de 1 (SD): 2 (SC) (solução final de sucrose de 0.083 M). As soluções obtidas são colocadas em placas de cultura de Nunc, filtradas através de membrana com 0,22 μm, gaseificada com mistura N2 90%, CO2 5% e 02 5% e mantida na temperatura ambiente. Assim sendo, as “paillettes” contendo embriões congelados são retiradas do N2L, deixadas por 30 segundos em temperatura ambiente, mergulhadas em banhomaria à 30¡C por 40 segundos sendo os embriões transferidos consecutivamente para as 3 etapas de diluições de sucrose (SD1, SD2 e SD3) pelo período de dez minutos em cada solução à temperatura ambiente. Após este período, os embriões são colocados em SC à temperatura ambiente por 5 minutos, e em seguida em micro gotas de SC cobertas por óleo à temperatura de 37ºC, e mantidos em atmosfera de CO2 5%, por período mínimo de 24h.
II- Método lento (Programa - 0 Criologic CL-863)
A - Método de congelamento
1 - Retirar o Freez-Kit 1 (Scandinavian IVF Science AB -ref: 6120) composto por: PBS, S-1 (1.5 M Propanodiol (PROH)) e S-2 (1.5 M de PROH + 0.1 M Sucrose) da geladeira e deixar estabilizar em temperatura ambiente, no mínimo 15 minutos.
2- Distribuir as soluções (PBS, S-1 e S-2) em placa de cultura de Nunc.
3- Estabilizar a criocâmara no nitrogênio líquido por 5 minutos, e deixar o programa estabilizar por 10 minutos.
4- Embriões são colocados em solução de PBS, por curto período.
5- Transferir os embriões para a S-1 por 10 minutos . Durante este período realizar a lavagem das paillettes (0.25 ml) na S-2.
6- Transferir os embriões para a S-2, rapidamente e realizar o preenchimento das paillettes, com o auxílio de seringa de tuberculina.
7- As paillettes são colocadas na câmara de congelamento equilibrada à 24 ºC, no programa 0.
8- Realizar o seeding (aproximadamente 17 minutos do início do programa) manualmente à -6.0 ºC.OBS: O recipiente contendo nitrogênio líquido (N2L) deve ser mantido fechado, recolocar N2L no momento do seeding e após em intervalos de 35-40 min.
9- Deixar o programa correr em queda livre até -150¡ C, após transferir as paillettes para o N2L.
B - Método de descongelamento.
1- Retirar o Thaw-Kit 1 (Scandinavian IVF Science AB - ref: 6130) composto por: S-1 (1.0 M de PROH + 0.2 M Sucrose), S-2 (0.5 M de PROH + 0.2 M de Sucrose), S-3 (0.2 M de Sucrose) e PBS.
2- Distribuir as soluções em placa de cultura de Nunc, deixar estabilizar em temperatura ambiente, no mínimo 15 minutos.
3- Remover as paillettes do N2L e deixar a temperatura ambiente por 30 segundos.
4- Transferir para banho - Maria (30¡C) por 40 segundos.
5- Enxugar cuidadosamente as “paillettes” cortar as extremidades, acoplar a seringa de 1ml e expelir o conteudo desta na S-1 pré estabilizada, por 5 minutos.
6- Transferir para a S-2 por 5 minutos.
7- Transferir para S-3 por 10 minutos.
8- Transferir para PBS sem soro por 5 minutos.
9- Transferir para novo PBS estabilizado a 5%CO2/37¡C, por 5 minutos.
10- Finalmente transferir para Solução de IVF-50 + 20% soro sintético substutivo (Irvine) pré-estabilzado (5%CO2/37¡C).
11 - Transferência será realizada após 24 hrs do descongelamento após a verificacão da clivagem embrionária.
Avaliação da sobrevida embrionária e clivagem após 24 horas
A taxa de sobrevida foi definida pela presença de pelo menos um blastômero intacto após o processo de descongelamento (Lai et al., 1996). Entretanto, os embriões foram analisados separadamente em termos de desenvolvimento e somente aqueles que apresentaram uma continuação do processo de clivagem foram transferidos para a paciente (Van der Elst et al., 1997). A clivagem embrionária após 24 horas foi considerada presente quando se observou a divisão de pelo menos um dos blastômeros (Lai et al., 1996).
Ciclos para transferência: natural e substitutivo
Dois esquemas hormonais foram utilizados para a transferência dos embriões descongelados : ciclo natural e ciclo substitutivo. No ciclo natural, o controle do desenvolvimento folicular é realizado por ultra-sonografia vaginal seriada a partir do 10º dia do ciclo. Uma dose de 5,000 UI HCG é administrada quando o folículo apresenta diâmetro3 18mm, sendo rotineiramente o descongelamento realizado no 4º dia após o HCG (dia da injeção do HCG = dia nº 1) e a transferência embrionária no 5º dia após o HCG.
No ciclo substitutivo, administra-se do 1º ao 13º dia do ciclo, valerianato de estradiol (VE) na dose diária de 4 a 6 mg. A progesterona é introduzida no 14º dia, via intramuscular, na dose de 50mg/dia, desde que a espessura endometrial seja superior a 6mm . O descongelamento é realizado após 4 dias do uso de progesterona e a transferência no 5º dia de progesterona.
Resultados
A faixa etária (grupo A = 31.4 ± 4.5; grupo B = 32 ± 4.3) não diferiu entre os grupos (p=0.37). O número de embriões congelados (grupo A = 6.7 ± 3.2; grupo B = 6.5 ± 3.2) foi semelhante (p=0.76). Por outro lado, o número de embriões descongelados também foi igual (p=0.32) (grupo A = 7.1 ± 3.1; grupo B = 6.6 ± 3.3) entre os grupos.
A taxa de sobrevida embrionária foi superior (p=0.02) no grupo B (79.8 ± 24.3%) do que no grupo A (65.3 ± 29.8%). A taxa de clivagem embrionária, também foi maior (p=0.001) no grupo B (55.4 ± 32.4%) quando comparada com o grupo A (23±21.1%).
O número de embriões transferidos não diferiu (p=0.73) entre os grupos (grupo A=3.32 ± 1.33; grupo B=3.47 ± 1.08). A taxa de implantação embrionária entre os grupos (grupo A = 6.5%; grupo B = 12.6%) foi semelhante (0.12).
A taxa de gravidez por descongelamento e por transferência embrionária foi superior no grupo B (33.3% e 37.5%, respectivamente) em comparação com o grupo A (13.6% e 16.2%, respectivamente), entretanto estas diferenças não foram significativas (p=0.058 e 0.34 respectivamente) (Tabela 1).
Tabela 1. Resultados do criocongelamento de embriões de ICSI pelo método ultrarápido (Grupo A) e pelo método lento (Grupo B)
Discussão
Com a introdução da revolucionária técnica da ICSI, os casais que possuiam um prognóstico desfavorável na FIV podem agora ser tratados com sucesso. Por outro lado, com as altas taxas de fertilização e implantação que podem ser obtidas em centros com experiência na utilização do ICSI, muitos embriões excedentes estão agora disponíveis para criopreservação em pacientes com fator masculino.
Apesar de uma extensa literatura referente a várias técnicas de criopreservação, há esparsas informações sobre o congelamento de embriões com a zona pelúcida perfrada.
Van Steirteghem et al. (1994) avaliaram o impacto do ICSI no que se refere as gestações provenientes de embriões congelados/descongelados pelo ML com DMSO e concluiram que poderia haver um aumento no risco de abortos clínicos e pré-clínicos.
Entretanto, Kowalik et al. (1998) usando o ML compararam os resultados após a criopreservação de embriões obtidos de ICSI e FIV. As taxas de sobrevida foram similares entre os dois grupos (70.5 e 73.2%, FIV e ICSI respectimamente) e não foram afetadas pelo estágio da criopreservação. Em adição, não houve diferenças significativas nas taxas de gravidez por transferência (31.8 e 32.3%), taxas de aborto pré-clínico (16.7 e 23.8%), ou nas taxas de aborto clínico (16.7 e 23.8%) entre os grupos de FIV e ICSI, respectivamente. Clinicamente, poucas unidades estão atualmente usando o MUR para o congelamento de embriões humanos excedentes. Trounson et al. (1988) e Trounson e Sjoblom (1988) relataram que embriões humanos de 3 a 8 células sobreviviam (com 50% de blastômeros intactos) ao congelamento/descongelamento com o MUR que usavam uma breve exposição a 3.5 M de DMSO e 0.25 M de sucrose. Entrtetanto, não obtiveram gestação.
Em Gordts et al. 1990, relataram os resultados da criopreservação pelo MUR de embriões humanos no estágio de prónucleo, com 94% de características morfológicas normais e 79% de clivagem após o processo de descongelamento. Um total de 34 embriões descongelados e clivados foram transferidos para 20 pacientes durante ciclos espontâneos e 4 gestações foram obtidas (20% de taxa de gravidez).
Em 1991, Feitchtinger et al. relataram sua experiência com o MUR. Um total de 181 embriões foram congelados e descongelados, com uma taxa de 61% de sobrevida (110) embriões com 50-100% de blastômeros intactos. A taxa de gravidez foi de 9.8% com a ocorrência de um aborto e uma gestação ectópica. Estes investigadores afirmaram que seus resultados foram similares àqueles obtidos em sua unidade com o ML usando propanediol.
Lai et al. (1996) relataram sua experiência com MUR aplicado em embriões humanos. Um total de 63 embriões foram descongelados, 83% dos quais (52 embriões) sobreviveram com pelo menos um blastômero intacto. Por outro lado, 19 transferências foram realizadas, com uma média de 2.7 embriões e 2 gestações de termo foram obtidas (10% de taxa de gravidez). Um aborto ocorreu após 8 semanas de gestação.
Por outro lado, na literatura não encontramos relatos da utilização do método ultra-rápido de congelamento/descongelamento na criopreservação de embriões provenientes do ICSI. No presente estudo uma modificação no descongelamento no método ultrarápido foi introduzida pela passagem em três etapas de concentrações diferentes de sucrose. Estas alterações foram baseadas nos estudos de Wilson and Quinn (1989), que usando o MUR para embriões de camundongo (3.5 M de DMSO), observaram um efeito protetor no desen volvimento embrionário quando o crioprotetor foi removido em diferentes etapas. Em adição, Vasuthevan et al. (1992) não observaram diferenças nas taxas de implantação e formação fetal quando o agente crioprotetor foi removido de embriões de camundongo em uma única etapa quando comparado com a remoção em duas etapas. Entretanto, o blastocisto formado após a remoção em uma etapa apresentava uma menor camada de células comparado com aqueles obtidos no procedimento em duas etapas.
Quando avaliamos os resultados obtidos neste estudo comparativo em que duas metodologias distintas são empregadas observamos que a taxa de sobrevida (79.8 ± 24.3%) e de clivagem embrionária (55.4 ± 32.4%) foi superior (p=0.02 e p=0.001; respectivamente) no grupo em que o ML foi utilizada quando comparadas com o grupo em que o MUR foi empregado (65.3 ± 29.8% e 23 ± 21. 1%, respectivamente). A taxa de gravidez por descongelamento e por transferência embrionária foi superior no grupo em que o ML (33.3% e 37.5%, respectivamente) em comparação com o grupo em que o MUR foi usado (13.6% e 16.2%, respectivamente), entretanto estas diferenças não foram significativas (p=0.058 e 0.34 respectivamente).
Quando comparado com o ML, o MUR é menos efetivo como método de criopreservação e esperamos que avanços sejam feitos para que esta técnica eventualmente consiga os mesmos resultados do que o ML, pois ela é mais rápida, fácil e reduz os custos, especialmente diminui o trabalho laboratorial.