JBRA Assist. Reprod. 1999;03(01):38-45
ARIGO DE ATUALIZAÇÃO
doi: 10.5935/1518-0557.1999.3.1.09
Resumo
A ausência de fertilização em reprodução assistida consiste na ausência total de fertilização dos ovócitos inseminados in vitro, evento o qual tem alta incidência nos centros especializados. Esta incidência pode chegar até a 20-24% segundo alguns autores. Para o bom entedimento e diagnóstico etiológico deste acontecimento, devemos ter conhecimento das técnicas propedêuticas e algumas causas da ausência de fertilização. Esta atualização se propõe a uma abordagem destas, e uma sugestão de conduta para o tratamento.
Unitermos: Fertilização in vitro, ausência de fertilização
Abstract
Fertilization failure in assisted reprodution consists of the total of absence of fertilization of the in vitro inseminated oocytes, event which has high incidence in the specialized centers. This incidence can be up to 20-24% according to some authors. For the good understanding and etiologic diagnosis of this event, we should have knowledge of causes and how diagnosis it. This review intends to make an aproach of these causes and suggests managements for the treatment.
Keywords: in vitro fertilization, fertilization failure
Introdução
A ausência de fertilização (AF) na Fertilização In Vitro (FIV) é um acontecimento em FIV cujos meios diagnósticos e proposições terapêuticas evoluíram de maneira bastante eficiente.
Segundo Sathananthan et al. (1993), a ausência de fertilização (AF) pode ser definida como a ausência completa de fertilização do “pool” ovocitário inseminado in vitro, isto é, a ausência de pronúcleo (PN) macho e fêmea entre o intervalo que se estende entre 16 e 18 horas após a inseminação. Os casos onde o rendimento da fertilização se verifica anormalmente fraco, quer dizer, a taxa de fertilização (número de ovócitos fecundados / número de ovócitos inseminados x 100) é < 20%, não são considerados como A, porém, pode se considerar que estes casos devem ser estudados da mesma maneira.
A taxa de ocorrência de AF varia consideravelmente entre os centros de FIV. A indicação da FIV, o tipo de estimulação ovariana ou mesmo as técnicas de fertilização utilizadas são elementos que fazem variar a incidência da AF. São poucos os dados na literatura sobre a incidência de AF. Oehninger et al. (1988) relataram uma incidência de AF de 5,70 em seu serviço, Lancaster et al. (1998) consideraram como aceitável uma incidência de AF entre 10 e 200, Lejeune et al. (1990) encontraram 18 e 240 de AF em uma importante série de FIV, a variação sendo considerada como não significatica e devido a dois tipos diferentes de protocolo de estimulação ovariana. Em outro estudo, Molloy et al. (1991) relataram uma incidência de 16% de AF sobre uma série de 2.322 pacientes.
A reincidência de AF não é maior em tentativas subsequentes em um mesmo casal. Estudando 94 casais com ciclos em que ocorreram ausência de fertilização sem causa identificável, Molloy et al. (1991) encontraram somente um casal que apresentou reincidência. Sabe-se que o estudo dos ciclos seguintes a um episódio de AF pode ser de importância para avaliação causal da ausência de fertilização.
A determinação dos fatores responsáveis por AF não é simples. Para facilitar seu estudo, divide-se em três etiologias básicas que podem se manifestar sozinhas ou com superposição:
- anomalias do espennaAs anomalias do esperma seriam as principais responsáveis pelas ausências de fertilização segundo vários estudos na literatura. Essa maior incidência, possivelmente, não seria verdadeira se levarmos em consideração a maior facilidade de estudar os parâmetros espennáticos e por causa da maior disponibilidade das amostras. A má qualidade ovocitária é a segunda grande causa da AF. Novas técnicas de estudo do fator ovocitário podem elevar a participação ovocitária como causa de AF. A fecundidade ovocitária é detenninada pela qualidade da resposta ovariana à estimulação, que por sua vez está diretamente relacionada a idade ovariana (Treloar, 1974).
- anomalias do ovócitos
- problemas técnicos ligados à fertilização
Diagnóstico
A investigação detalhada dos casos de ausência de fertilização é um dos pontos vitais da boa perfonnance em todo serviço de fertilização in vitro. Os casos de AF e o baixo rendimento da fertilização (taxa de fertilização < 20%) devem ser estudados da mesma maneira.
1) O fator espermático:
Serão considerados os meios diagnósticos que podem orientar o clínico na investigação de uma causa espermática de ausência de fertilização. Porém, não serão analisados os fatores etiológicos das anomalias espennáticas. A investigação das diferentes doenças que podem ser direta ou indiretamente associadas a uma diminuição da qualidade espermática e o perfil bioquímico do espenna, também fundamentais em toda exploração de um fator masculino de infertilidade, escapa ao objetivo desta exposição.
a) espennograma - espennocitograma:
Nos nossos dias, o diagnóstico das anomali as incapacitantes dos espermatozóides à fertilização não se pode orientar apenas nas informações oferecidas pelos parâmetros básicos do espermograma-espennocitograma. Os espermas considerados normais (segundo a Organização Mundial de Saúde: pH 7-8, concentração > 20 milhões/ml, mobilidade > 50% (formas a e b), fonnas típicas > 30%, vitalidade > 50%, leucócitos < 1.000.000/ml, aglutinação < 10%, WHO, 1992) podem mostrar um poder fecundante menor que o esperado, tão como, a situação inversa é igualmente verdadeira. Para a confirmação dos dados do espennograma, este deve ser repetido pelo menos uma vez nas condições técnicas ideais.
As publicações que estabeleciam um prognóstico previsível entre os parâmetros espenáticos e o sucesso da FIV. Acosta et al. (1986) observaram que ainda com mobilidade menor que 10%, não houve influência negativa na fertilização e gravidez. O estudo inicial de Kruger et al. (1986), enfatizou a morfologia do espennatozóide (morfologia estrita). Os autores estudando 190 ciclos de FIV notaram uma baixa significatica das taxas de fertilização e de gravidez logo que a concentração de formas típicas estavam inferior a 14%. No mesmo estudo, Kruger et al. (1986), analisando um grupo de pacientes apresentando menos de 14% de formas normais, relatou uma associação da mobilidade espennática com a morfologia sobre os resultados da FIV. Deve ser considerado que a técnica de fertilização utilizada nesses dois estudos requereria 50.000 espenatozóide móveis/ml por ovócito. Lin & Gordon (1988) mostraram a importância das anomalias acrossômicas sobre o resultado da FIV. Jeulin et al. (1986) observaram que os resultados da fertilização podiam ser pré-determinados nos casos onde os parâmetros do espenograma estavam alterados, sobretudo a qualidade dos movimentos do espermatozóide e sua morfologia (notadamente as malfonações ao nível do acrossomo). A concentração espenática foi também descrita como um dos fatores do mal rendimento da fertilização. Yovich & Stanger (1984) infonaram uma queda das taxas de fertilização quando a concentração espermática ultrapassava o limiar inferior de 5 milhões/ml. Os autores também relataram alguns casos de gravidez em situações à princípio desfavoráveis, o que sustenta a idéia que os dados do espennograma devem ser valorizados com precaução.
b) O teste de penetração espenática
A qualidade da migração espenática no muco in vitro é um meio simples de acesso aos parâmetros da mobilidade (função do flagelo) do espena. Segundo essas infonnações e aquelas dadas pela análise automática do movimento assistida pelo computador, indica-se uma exploração ultra-estrutural do espermatozóide pela microscopia eletrônica.
c) Os sistema CASA e CASMA:
Conscientizado do pequeno poder prognóstico dos espermogramas em relação aos resultados da fertilização, se impõe a aplicação de métodos de maior valor na análise dos parâmetros espermáticos. Os sistemas assistidos pelo computador fizeram um aperfeiçoamento Da técnica. O CASA (computer-assisted semen analysis) é um método que permite acesso rápido aos diferentes parâmetros espermáticos. A precisão dos resultados, forecidos por este sistema em comparação com as análises espermáticas tradicionais, é no entanto, motivo de controvérsia.
O sistema CASMA (computer-assisted sperm motility analysis) permite a análise das características qualitativas, a mobilidade espermática. Ele se baseia sobre diferentes parâmetros tais como a VCL (curvilinear velocity), a VAP (average path velocity), a VSL (linear velocity), a ALH (amplitude of lateral head displacement) e a BCF (beat-cross frequency). O CASMA permite também o cálculo das taxas de progressão (progression ratios) dos esprmatozóides, segundo a análise dos diferentes produtos matemáticos entre os parâmetros da velocidade (VCL, VAP e VSL). O interesse dos sistemas CASMA na avaliação do poder fecundante dos espermatozóides em FIV foi dado por Jeulin et al. (1986). Este estudo destacou que valores da ALH eram significativamente menores nos grupos de pacientes cuja taxa de fertilização era menor ou igual a 33%.
d) Os testes imunológicos
A idéia que a fertilização poderia ser impedida pela presença de anticorpos espermáticos não é recente, e Landsteiner (1989) já evidenciava tal possibilidade. Existem dois tipos diferentes de imunização, a imunização feminina e a auto imunização no homem. Não somente a concentração, mas também, o tipo de imunoglobulina pode ser importante no prognóstico. Em Coombs et al. 1973, dava ênfase sobre a participação equivalente da IgA e da IgG sobre espermatozóides, sendo prejudiciais a fertilização. Clarke et al (1985) confirmaram esta observação. Elder et al. (1990) encontraram uma incidência de 23,9% de AF sobre uma série de 113 ciclos de FIV cujos espermatozóides utilizados apresentaram IgG colados a sua superfície. A possibilidade de uma ação sinergética entre as duas classes de anticorpos é proposta. É considerada normal a presença de até 2% de anticorpos antiespermatozóides em casais ferteis. A detecção em casais inferteis pode ser de 5 a 25%, por Marshburn & Kurtteh (1994).
e) A microscopia eletrônica
As anomalias morfológicas dos espermatozóides segundo seus tipos e intensidade podem se constituir um obstáculo a fertilização. As causas de AF são algumas vezes ligadas às alterações ultra-estruturais do espermatozóide, somente visíveis através da microscopia eletrônica. O estudo em microscopia eletrônica da varredura (S.E.M.) ou da transmissão (T.E.M.) permite uma análise muito mais delicada da morfologia espermática.
A porcentagem de formas típicas observada em microscopia ótica pode passar de 60% para 30%, ou mesmo 15% quando analisada na microscopia eletrônica. As malformações do acrossomo muitas vezes despercebidas aos métodos clássicos podem ser incompatíveis com a penetração da membrana pelúcida ou a fusão com a membrana citoplasmática do ovócito. Os defeitos estruturais do flagelo são também capazes de dificultar a fertilização sobretudo alterando a qualidade e a eficácia do movimento espermático.
A microscopia eletrônica é uma etapa muito importante na exploração das A que pode dar informações úteis, não somente por sua compreensão, mas também pela orientação terapêutica.
f) O teste de penetração espermática hétero-específica (teste de hamster):
A utilização de ovócito de hamster para avaliar o estado de capacitação dos espermatozóides humanos foi descrito pela prmeira vez em 1976, por Yanagimachi (1976). Em 1978, Barros et al. (1978) demonstraram que o teste de hamster oferecia resultados mais fracos que o espermograma na avaliação do poder fecundante do espermatozóide. O teste de hamster desde sua primeira descrição sofreu algumas modificações com objetivo de aproximar seus resultados com aqueles da fertilização homóloga. De toda maneira, a interpretação dos dados do teste de hamster é assunto de controvérsias. Rogers et al. (1979) e Margalioth et al. (1983) consideraram a incidência de 15% de cabeças descondensadas como o limite inferior do normal, a partir da qual, o esperma seria não fecundante.
g) O “hemizona assay” (HZA)
Ao contrário do teste de penetração espermática (teste de hamster) o HZA permite explorar a capacidade dos espermatozóides de se fixar sobre a membrana transparente dos ovócitos humanos mortos. Essa propriedade é espécie-dependente e foi originalmente descrita por Overstreet et al. (1976). Esse teste consiste em colocar em contato os espermatozóides a analisar com a metade de um ovócito humano obtido a partir dos fragmentos de tecido ovariano. O material ovariano provêm de peças cirúrgicas (ovariectomias) ou de cadáveres e é posteriormente conservado em uma solução salina. O ovócito pode ser igualmente um ovócito não fecundado em FIV e oferecido pelo casal à pesquisa científica. Esses ovócitos são em seguida cortados em duas metades por micromanipulação. A segunda metade vai ser exposta a espermatozóides normo-fecundantes e servir de controle.
Burkman et al. (1988) estudando o teste HZA encontraram uma capacidade fixadora sobre a membrana significativamente menor dos espermas que tinham se frustrado uma ou várias vezes nas tentativas de FIV precedentes (uma AF ou mais) em comparação com os controles férteis. Recentemente, Oehninger et al. (1991) adotaram o teste HZA de rotina no quadro de balanço da AF.
h) O teste de penetração espermática homo-específica segue os mesmos princípios do teste de hamster:
Os ovócitos utilizados para o teste são ovócitos não fecundados em um ciclo de FIV e que estavam de acordo com a utilização de mais gametas para a pesquisa. Seu princípio se apoia sobre o fato que os ovócitos que não foram fecundados guardam seu poder de penetração e fertilização durante um certo tempo. Como no teste de hamster, é retirada a zona pelúcida destes ovócitos, e em seguida colocados em fertilização com o esperma a testar e o esperma-controle (doador fértil). Tesarik (1989) propôs que os resultados do teste de penetração espermática homóloga eram equivalentes àqueles do teste do hamster. Sua vantagem principal seria a possibilidade de reutilizar os ovócitos normalmente destinados à eliminação nos serviços de FIV onde a obtenção dos ovócitos de hamster seria difícil.
i) O teste de fertilização cruzado:
Esse teste permite avaliar paralelamente a capacidade de fertilização dos gametas do casal (esperma + ovócito). Consiste em colocar em fertilização o esperma do homem a ser avaliado com ovócitos originados de doadora fértil e os ovócitos da mulher a ser avaliada, com o esperma do doador fértil, após o consentimento formal dos pacientes.
Ainda que sua utilização possa suscitar algum questionamento do ponto de vista ético, o teste de fertilização cruzada permite a obtenção de informações simultâneas sobre a qualidade espermática e ovocitária.
j) O teste de fixação espermática sobre a zona pelúcida:
Esse teste foi apresentado por Liu et al. (1989) para analisar a capacidade dos espermatozóides de se fixar sobre a zona transparente. Os ovócitos humanos não fecundados em FIV são examinados no microscópio de fase invertida e a quantidade de espermatozóides fixados sobre a zona pelúcida estimada. Os autores encontraram uma correlação inversa entre o número de espermatozóides fixados e a taxa de fertilização em FIV e sugeriram que o fraco grau de fixação seria mais associado a anomalias espermáticas do que à ovocitárias.
k) Os testes de avaliação da função nuclear e de reacão acrossômica:
O grau de maturação nuclear pode ser avaliado pelo emprego de testes colorimétricos como o teste ao azul de anilina que coloca em evidência a maturidade das proteínas nucleares e o teste da acridina laranja que permite o acesso às informações sugerindo a quantidade de DNA espermático
Alguns marcadores colorimétricos ou imunológicos podem dar uma idéia aproximada sobre a reação acrossômica, como tripla coloração de Talbote Chacon (1981) ou as técnicas citoquímicas utilizando as lecitinas fixadas no flurisotiocianato ou, mais recentemente, imunocitoquímicas com a ajuda dos anticorpos monoclonais.
2) As anomalias do ovócito:
O grau de participação das anomalias próprias ao ovócito nas etiologias das ausências de fertilização não está totalmente definido. Em todo caso, parece que uma parte considerável das AF deve ser atribuída a uma fecundidade ovocitária. A imaturidade ou as anomalias da maturação como vesículas germinativas persistentes, a formação do corpúsculo polar e as degenerações ovocitárias intrafoliculares, as alterações cromossômicas ou mesmo as anomalias citoplasmáticas e cromatínicas do ovócito podem ser responsáveis por uma performance ruim ou mesmo nula da fertilização, quando expostas a espermas considerados como normofecundantes.
Para análise dos fatores ovocitários subdividimos o estudo desta forma:
a) Microscopia Eletrônica:
O interesse pela microscopia eletrônica no diagnóstico das causas ovocitárias de AF esta fudamentado na idéia que o exame clássico do ovócito com a ajuda do microscópio ótico pode ser insuficiente para a identificação de certas anomalias. Sundstrom et al. (1985) demonstraram que 20% dos ovócitos imaturos que tinham uma aparência normal ao microscópio ótico tinham já começado o processo de atresia. A microscopia eletrônica pode facilitar o diagnóstico de presença ou ausência dos corpúsculos polares ou dos pró-núcleos, frequentemente difícil com os métodos tradicionais.
b) A ánalise citogenética:
O acesso às características genéticas dos ovócitos não fecundados pela análise citogenética é tecnicamente um processo difícil, cujos resultados não são sempre satisfatoriamente interpretáveis. Em todo caso, trata-se de ção salina. O ovócito pode ser igualmente um ovócito não fecundado em FIV e oferecido pelo casal à pesquisa científica. Esses ovócitos são em seguida cortados em duas metades por micromanipulação. A segunda metade vai ser exposta a espermatozóides normo-fecundantes e servir de controle.
Burkman et al. (1988) estudando o teste HZA encontraram uma capacidade fixadora sobre a membrana significativamente menor dos espermas que tinham se frustrado uma ou várias vezes nas tentativas de FIV precedentes (uma AF ou mais) em comparação com os controles fé rteis. Recentemente, Oehninger et al. (1991) ado taram o teste HZA de rotina no quadro de balanço da AF.
h) O teste de penetração espermática homo-específica segue os mesmos princípios do teste de hamster:
Os ovócitos utilizados para o teste são ovócitos não fecundados em um ciclo de FIV e que estavam de acordo com a utilização de mais gametas para a pesquisa. Seu princípio se apoia sobre o fato que os ovócitos que não foram fecundados guardam seu poder de penetração e fertilização durante um certo tempo. Como no teste de hamster, é retirada a zona pelúcida destes ovócitos, e em seguida colocados em fertilização com o esperma a testar e o esperma-controle (doador fértil). Tesarik (1989) propôs que os resultados do teste de penetração espermática homóloga eram equivalentes àqueles do teste do hamster. Sua vantagem principal seria a possibilidade de reutilizar os ovócitos normalmente destinados à eliminação nos serviços de FIV onde a obtenção dos ovócitos de hamster seria difícil.
i) O teste de fertilização cruzado:
Esse teste permite avaliar paralelamente a capacidade de fertilização dos gametas do casal (esperma + ovócito). Consiste em colocar em fertilização o esperma do homem a ser avaliado com ovócitos originados de doadora fértil e os ovócitos da mulher a ser avaliada, com o esperma do doador fértil, após o consentimento formal dos pacientes.
Ainda que sua utilização possa suscitar algum questionamento do ponto de vista ético, o teste de fertilização cruzada permite a obtenção de informações simultâneas sobre a qualidade espermática e ovocitária.
j) O teste de fixação espermática sobre a zona pelúcida:
Esse teste foi apresentado por Liu et al. (1989) para analisar a capacidade dos espermatozóides de se fixar sobre a zona transparente. Os ovócitos humanos não fecundados em FIV são examinados no microscópio de fase invertida e a quantidade de espermatozóides fixados sobre a zona pelúcida estimada. Os autores encontraram uma correlação inversa entre o número de espermatozóides fixados e a taxa de fertilização em FIV e sugeriram que o fraco grau de fixação seria mais associado a anomalias espermáticas do que à ovocitárias.
k) Os testes de avaliação da função nuclear e de reacão acrossômica:
O grau de maturação nuclear pode ser avaliado pelo emprego de testes colorimétricos como o teste ao azul de anilina que coloca em evidência a maturidade das proteínas nucleares e o teste da acridina laranja que permite o acesso às informações sugerindo a quantidade de DNA espermático
Alguns marcadores colorimétricos ou imunológicos podem dar uma idéia aproximada sobre a reação acrossômica, como tripla coloração de Talbote Chacon (1981) ou as técnicas citoquímicas utilizando as lecitinas fixadas no flurisotiocianato ou, mais recentemente, imunocitoquímicas com a ajuda dos anticorpos monoclonais.
2) As anomalias do ovócito:
O grau de participação das anomalias próprias ao ovócito nas etiologias das ausências de fertilização não está totalmente definido. Em todo caso, parece que uma parte considerável das AF deve ser atribuída a uma fecundidade ovocitária. A imaturidade ou as anomalias da maturação como vesículas germinativas persistentes, a formação do corpúsculo polar e as degenerações ovocitárias intrafoliculares, as alterações cromossômicas ou mesmo as anomalias citoplasmáticas e cromatínicas do ovócito podem ser responsáveis por uma performance ruim ou mesmo nula da fertilização, quando expostas a espermas considerados como normofecundantes.
Para análise dos fatores ovocitários subdividimos o estudo desta forma:
a) Microscopia Eletrônica:
O interesse pela microscopia eletrônica no diagnóstico das causas ovocitárias de AF esta fudamentado na idéia que o exame clássico do ovócito com a ajuda do microscópio ótico pode ser insuficiente para a identificação de certas anomalias. Sundstrom et al. (1985) demonstraram que 20% dos ovócitos imaturos que tinham uma aparência normal ao microscópio ótico tinham já começado o processo de atresia. A microscopia eletrônica pode facilitar o diagnóstico de presença ou ausência dos corpúsculos polares ou dos pró-núcleos, frequentemente difícil com os métodos tradicionais.
b) A ánalise citogenética:
O acesso às características genéticas dos ovócitos não fecundados pela análise citogenética é tecnicamente um processo difícil, cujos resultados não são sempre satisfatoriamente interpretáveis. Em todo caso, trata-se de um estudo que pode fornecer elementos conclusivos para o diagnóstico das causas ovocitárias da AF. Esse método permite não somente uma avaliação da maturidade nuclear do ovócito, mas também da maturidade citoplástica. Poderiam haver fatores que levariam a condensação prematura de cromossomos de espermatozóides, necessária para a formação do prónúcleo masculino. Isto ocorre mais frequentemente em ovócitos imaturos. A análise citogenética pode oferecer também informações sobre as causas das paradas precoces do desenvolvimento embrionário uterino.
A incidência das anormalidades cromossômicas do ovócito não inseminados e não fertilizados oscilam entre 3% a 56% segundo diversas fontes e estudos. Parece que na grande maioria de casos trata-se de anomalias numéricas, cerca de 95%, contra apenas 5% de anomalias estruturais. Pieters et al (1989) descreveram a ocorrência de hipohaploidia < 23 cromossomos X) em 62,5% dos ovócitos estudados e da aneuploidia em 35,3% dos ovócitos não fecundados. Plachot et al (1987) e Wransby & Frega (1987) mostraram taxas de aneuploidia similares (32% e 48%) estudando os ovócitos que tinham fracassado na fertilização. A ocorrência de triploidia se situa em toro de 5% Pieters et al. (1991).
c) O DNA fluorescência:
É uma técnica recente que consiste em observar os ovócitos em microscopia ótica após coloração prévia com um corante de DNA específico (Hoechst 33342). O Hoeschst 33342 permite a análise da distribuição e da cromatina no interior do ovócito segundo a descrição de O’Rand et al. (1986) e Conover et al. (1988). O DNA fluorescência é uma técnica rápida e simples que oferece a vantagem de permitir o estudo de ovócitos vivos. Conover et al. (1992), estudando com essa técnica ovócitos não fecundados em FIV, sugeriram que se apenas uma parte do “pool” ovocitário recolhido não é fecundado, a causa da não fertilização seria associada à imaturidade nuclear dos ovócitos, entretanto se nenhum ovócito for fecundado, a AF seria devido a problemas funcionais do esperma, uma má fixação sobre a zona pelúcida ou anomalias citoplasmáticas do ovócito.
3) Os problemas técnicos ligados à fertilização:
A AF pode ser ligada a fatores independentes da qualidade dos gametas. As técnicas empregadas n sua manipulação e o material que vai entrar em contato com os gametas devem ser também analisados para obtenção de um diagnóstico etiológico das AF.
A análise dos métodos de estocagem do esperma e do ovócito pode evidenciar falhas técnicas ou fatores tóxicos. No quadro de prevenção de AF devido a problemas técnicos, alguns autores utilizam de rotina os embriões de ratos para testar a toxidade de seu equipamento.
Recentemente, os processos clássicos de preparação do esperma como as lavagens sucessivas após centrifugação, foram expostas como possíveis causas de AF. Mortimer (1991) sugere que há a possibilidade desses métodos favorecerem a liberação de radicais superoxidados pelas células presentes no plasma cervical e, como outros investigadores, defende a utilização dos métodos alterativos, tais como a migração sobre gradiente de Percoll ou de Nycodenz.
Notadamente a quantidade de espermatozóide inseminados por ovócitos necessários para a fertilizção apresenta um papel decisivo. Protocolos recentes que utilizam micro-gota, requerem somente 5.000 a 7.000 espermatozóides móveis por ovócito, o que pode favorecer enormemente os resultados da fertilização nas oligosperas severas puras, ou nos casos, onde após a seleção das formas móveis e típicas, se depara com um número diminuído de esprmatozóides para a inseminação. Em estudo recente, Aikten (1994) demonstrou que há a formação de radicais livres no meio de cultivo dos oócitos, que seria diretamente relacionado com os espermatozóides restantes, que ao degradar-se promoveriam a liberação destes. Para a confirmação deste estudo, Nasr-Esffahani et al. (1990) adicionaram antioxidantes aos meios de cultura promovendo um maior desenvolvimento embrionário.
Também com relação aos estudos de liberação dos radicais livres, Giannaroli et al. (1996) fizeram um estudo randomizado, dividindo as pacientes em dois grupos, sendo que no primeiro o tempo de interação ovócitoespermatozóide para a fertilização era de uma hora e no segundo grupo de 16 horas. Encontraram como resultado uma maior taxa de sucesso gestacional nas pacientes do primeiro grupo, estatisticamente significante, o que mostrou que a exposição prolongada aos espermatozóides foi deletéria ao desenvolvimento do oócito.
Tratamento
O tratamento dos casos de ausência de fertilização está diretamente relaciondo com o fator etiológico. Estão divididas as causas e possibilidades terapêuticas de acordo com o fator causal:
a) O fator espermático:
Aumentar o fator fecundante do esperma não é uma tarefa simples. Os métodos atuais de preparação, como a seleção espermática por migração sobre gradiente de concentração (Percoll) ou “swim-up”, assim como as novidades técnicas de fertilização ditas econômicas como a fertilização em micro-gotas (30 microlitros) de meio de cultura sob óleo de parafina permitirá, contudo a obtenção de resultados relativamente satisfatórios em face das condições anteriormente consideradas como intransponíveis.
Com resultados controversos, foram realizados estudos com a aplicação de imunoglobulinas em pacientes com três ou mais tentativas fracassadas de FIV e transferência de embrião (Coulan et al., 1994). Esta era aplicada durante o ciclo de estimulação ovariana e foi obtida uma taxa de fertilização maior no grupo que recebeu aplicação de imunoglobulina do que no grupo que recebeu placebo, embora não estatisticamente significante. Existem outros estudos concordantes e também outros que tem resultados mostrando a falência do método, como o estudo de Balash et al. (1996). Foi dado um grande passo na melhora do prognóstico dos casos de infertilidade por fator masculino com o avanço tecnológico na micromanipulação de gametas. Estas técnicas permitem a fertilização em casos de oligospermias muito severa ou criptozoospermia, quando se faz uso da biópsia de testículo.
Das várias técnicas criadas inicialmente, algumas já foram abandonadas por sua baixa eficácia. Dentre estas podemos citar a SUZI (inseminação subzonal) e a PZD (dissecção parcial de zona), que por suas baixas eficácias foram abandonadas da prática clínica. Atualmente a técnica mais utilizada é o ICSI (injeção intra-citoplasmática).
Esta técnica tem sido a grande esperança dos centros de fertilização in vitro. A inseminação intracitoplasmática, primeiramente descrita por Palermo et al. (1993), se dá com a in jeção de um espermatozóide dentro do citoplasma de um ovócito previamente imobilizado. O sucesso desta técnica é bem maior que das técnicas anteriores, e pode ser aplicada para casos graves de malformações de espermatozóides e baixo número total no ejaculado.
b) O fator ovocitário:
O tratamento do fator ovoitário é também estitamente depndente do diagnóstico das anomalias encontradas na época da avaliação do ovóito não fecundado e da análise retospectiva da qualidade de resposta ovariana à estimulação. As pacientes cuja reserva ovariana é baixa produzirão frequentemente ovócitos de baixa qualidade e/ou em pequeno número. Uma correlação inversa entre o número de ovócitos obtidos e a taxa de fertilização foi citada por Barlow et al. (1990) e Molloy et al. (1991). Essas pacientes apresentam em geral um mau recrutamento folicular e índices insuficientes de estradiol. Parece que outros distúrbios endócrinos estariam igualmente associados, como uma incidência maior de luteinização prematura e um período mais longo de dessensibilização hipofisária seguida da tomada dos agonistas de GnRH.
Uma das primeiras medidas a ser tomada no tratamento do fator ovocitário é então a realização dos testes para avaliação da reserva ovariana, que permitirão ter acesso a informações sobre o perfil hormonal ovariano basal e sob simulação. Um tipo de estimulação adaptada às necessidades endócrinas da paciente, assim como um monitoramento atento e criterioso deverão ser em seguida considerados.
Tendo-se conhecimento da importância da maturidade ovocitárias entre as causas da AF, os estudos sobre as possibilidades de maturar ovócitos in vitro foram analisados com alguns bons resultados. O diagnóstico das anomalias ovocitárias, tais como o grau de maturação não deve ser baseado somente nos meios clássicos, como o exame da grande dispersão do cumulus e da expansão da corona radiata. Conover et al. (1989) demonstraram que mais da metade dos ovócitos considerados maduros pelos meios tradicionais era composta de ovócitos imaturos segundo os parâmetros da DNA fluorescência. Os autores baseados nesses resultados realizaram a reinseminação dos ovócitos maduros não fecundados com resultados positivos.
De forma objetiva, após 1 ou 2 casos de não fertilização, excluindo-se o fator masculino, deve-se optar pelo ICSI na tentativa de melhora da taxa de sucesso.
Conclusão
Como foi visto anteriormente existem muitas causas que estão relacionadas com uma falha na fertilização em laboratórios de fertilização “in vitro” , e estas podem estar relacionadas com fatores espermáticos, ovocitários e das técnicas de manipulação e preparação dos gametas. Todos os centros de fertilização devem ter um bom controle e análise dos seus casos de ausência de fertilização para a melhoria de seus próprios resultados e avanço no conhecimento sobre as possíveis causas de falha.
Deve ser lembrada a grande importância das técnicas de micromanipulação (ICSI) por terem ampliado muito a possibilidade de sucesso em casos de fator masculino de infertilidade e não fertilização, e salientado que a continuidade das pesquisas levará a uma melhora no prognóstico de todos os casos.
Aitken J.R. - A free radical theory of male infertility -Reprod. Fertil Dev., 6: 19-54, 1994.