JBRA Assist. Reprod. 1999;03(02):6-10
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1999.3.2.02
Análise do desenvolvimento de embriões multinucleados em pacientes induzidas com FSH recombinante e submetidas ao ICSI (intracytoplasmatic sperm injection)
An analisys of multinucleated blastomere embryos in patients induced with recombinant FSH and submitted to ICSI (intracytoplasmatic sperm injection)
Resumo
Introdução: A morfologia nuclear, juntamente com a fragmentação e a simetria dos blastômeros, deve ser incluída na observação dos embriões a serem transferidos, pois sua importância clínica parece ser relevante. A presença de multinucleação leva a um desenvolvimento embrionário mais lento e à uma menor probabilidade de implantação. O objetivo deste estudo foi comparar os ciclos em que houve pelo menos um embrião com blastômero multinucleado (BMN), derivado de óvulos fertilizados normalmente (2 pronúcleos - 2PN), com aqueles onde somente foram observados embriões mononucleados.
Material e Métodos: Foram estudados retrospectivamente 32 ciclos onde pelo menos um embrião apresentava BMN (GBMN) e comparados com 108 ciclos onde todos os embriões eram mononucleados, sendo este o grupo controle (GC). O estímulo ovulatório empregado foi o regime de protocolo longo com bloqueio na fase lútea com acetato de Leuprolide (Lupron-Abbott) seguido de FSH recombinante (FSHr, Puregon, Organon) em dose fixa (200 UI ou 300 UI/dia) ou em dose variável (“step-down”). O ICSI foi realizado em todo oócito em MII, obtido por aspiração ovariana guiada por ultra-som.
Resultados: Foram estudados 855 embriões (266 do GBMN e 589 do GC), sendo observados 49 embriões multinucleados (5,7% do total de embriões). Quando comparados o GBMN e o GC, o número médio de folículos de oócitos em MII, de 2 PN e o número médio de embriões, foram significativamente maiores no GBMN (18.5 vs 15.1 (a); 12.8 vs 9.7 (a); 9 vs 7.1 (a); 7 vs 4.5 (b); 8.3 vs 5.6 (b); “Student t test” - a: P < 0.05; b: P < 0.01). Não houve diferença na idade das pacientes (34.2 anos vs 34.3 anos), nos níveis de estradiol (E2 no dia do HCG, 2988 pg/ml vs 2496 pg/ ml), na quantidade de unidades de FSHr (2492 UI vs 2459 UI), no número de embriões fecundados anormalmente (10.5% vs 10.2%), assim como nas taxas de implantação (12% vs 11%), gestação por transferência (33.3% vs 20.6%) e aborto (30% vs 28.5%) para o GBMN e GC. Não houve também diferença entre o protocolo de indução e a prevalência de blastômeros multinucleados (43,75% × 56,25% no GBMN e 43,52% × 56,48% no GC, dose variável × dose fixa, respectivamente).
Conclusão: A presença de embriões com blastômeros multinucleados é associada com uma resposta mais exuberante à terapia com FSHr, refletida pelo maior recrutamento folicular e maiornúmero de óvulos. Apesar de já conhecido que embriões com BMN apresentam menor capacidade de desenvolvimento e consequentemente menor prognóstico, a sua presença não modificou os resultados de implantação, gravidez e aborto em pacientes estimuladas com FSHr e submetidas ao ICSI.
Unitermos: blastômeros multinucleados, indução de ovulação, FSH recombinante
Abstract
Introduction: Nuclear morphology, fragmentation and blastomere symmetry must be considered before embryo transfer as they seem to bear some clinical relevance. Multinucleation may signify a slower embryo development. degree and low implantation rate. The aim of this study was to compare cycles of ·ovulatory stimulation in which at least one blastomere was multinucleated (MNB), originated from normally fertilized eggs (2PN), with those where just mononucleated embryos were observed.
Material and Methods: Between January and August 1998, 32 cycles of ovulatory stimulation where at least one embryo presented with MNB (MNBG), were compared with 108 cycles where all embryos had blastomeres with just one nucleus (control group - CG) . Ovulatory induction was performed using the long protocol with leuprolide acetate for lutheal phase blockage (Lupron-Abbott), followed by recombinant FSH (rFSH- Puregon-Organon) in prefixed dosage (200 or 300 IU/day) or in variable dosage (“step-down”). ICSI was performed in all oocytes in MII, obtained by ultrasound guided ovarian aspiration.
Results: A total of 855 embryos were studied (266 from MNBG and 589 from CG). Forty-nine multinucleated embryos (5,7% of the total of embryos) were obtained. When compared both groups (MNBG and CG), the average number of follicles, oocytes, oocytes in MII, 2 PN and the average number of embryos, all these parameters were significantly higher in the MNBG (18.5 vs 15.1 (a); 12.8 vs 9.7 (a); 9 vs 7.1 (a); 7 vs 4.5 (b); 8.3 vs 5.6 (b); “Student t test”- a: P < 0,05; b: P < 0.01). There was no difference in patients age (34.2 years vs 34.3 years), estradiol levels (E2-at HCG day, 2988 pg/ml vs 2496 pg/ml), units of rFSH employed (2492 IU vs 2459 IU) and number of abnormally embryos (10.5% vs 10.2%). Also, no difference was found in implantation (12% vs 11%) and pregnancy rates per transfer (33.3% vs 20.6%) and miscarriage rates (30% vs 28.5%) for MNBG and GC. No difference was observed between the type of stimulation protocol and the incidence of multinucleated blastomeres (43,75% × 56,25% for MNB and 43,52% × 56,48% for CG, variable dose × fixed dose, respectively).
Conclusions: The presence of multinucleated blastomeres is associated with a higher response to the therapy with rFSH, reflected by the higher follicular recruitment and higher number of oocytes. Although it is well known that embryos with MNB present a smaller capacity of development and worst prognosis, its presence did not modified implantation rates, pregnancy and miscarriage rates in patients submitted to stimulation with rFSH and ICSI.
Keywords: multinucleated blastomeres, ovulation induction, reconbinant FSH
Introdução
Os sistemas de classificação embrionária convencionais incluem estágios de desenvolvimento do embrião, grau de fragmentação e simetria dos blastômeros. Baseado nestes conceitos, embriões podem ser considerados morfologicamente normais se alcançarem o estágio de duas a quatro células no segundo dia de desenvolvimento, seis a oito células no terceiro e apresentarem simetria entre os blastômeros associada à pouca ou nenhuma fragmentação. Porém, esta metodologia de classificação torna-se falha por não incluir a morfologia nuclear dos blastômeros, uma avaliação de extrema importância (Jackson et. al., 1998).
Após a primeira divisão mitótica, no segundo dia de desenvolvimento embrionário, são considerados embriões morfologicamente normais aqueles que apresentam um único núcleo em cada blastômero. Multinucleação de blastômeros humanos foi relatada pela primeira vez como resultado de fertilização polispérmica (Van Blerkom et. al., 1984). Entretanto, novas tecnologias permitiram observações mais apuradas indicando que esta anormalidade nuclear também pode se desenvolver em embriões derivados de oócitos fertilizados normalmente exibindo dois pronúcleos (2 PN) e dois corpúsculos polares (2CP) (Balakier e Cadesky, 1997).
Embriões estudados por hibridização fluorescente “in situ” (FISH), contendo blastômeros multinucleados, mostraram maior probabilidade de alterações cromossômicas na maioria das células, especialmente quando a multinucleação aparece precocemente, na primeira ou segunda divisão celular. A incidência de multinucleação também mostrou-se maior em embriões com desenvolvimento lento ou parada de clivagem (Munné e Cohen, 1993; Munné et. al., 1994). Por estas razões, deve-se evitar a transferência de embriões contendo blastômeros multinucleados, à menos que não existam outros disponíveis. Porém, conhece-se pouco sobre taxas de gravidez e implantação destes embriões, sabendo-se apenas que a implantação dos mesmos é menor que embriões normais.
O objetivo deste estudo foi comparar os ciclos em que houve a presença e transferência de pelo menos um embrião com blastômeros multinucleados (BMN), derivado de oócitos fecundados normalmente (2 PN) com aqueles onde somente foram transferidos embriões com blastômeros mononucleados. Foram comparados: 1) estímulo ovulatório; 2) número de oócitos em metáfase II; 3) número total de 2 PN e de embriões; 4) número de oócitos com fertilização anormal; 5) taxas de implantação, gravidez clínica e aborto.
Material e método
Pacientes
No período de janeiro a agosto de 1998, foram estudados retrospectivamente 140 ciclos de ICSI. Em trinta e dois ciclos transferiu-se pelo menos um embrião apresentando um ou mais blastômeros multinucleados (Grupo dos blastômeros multinucleados - GBMN). Este grupo foi comparado com 108 ciclos onde todos os embriões transferidos apresentavam somente blastômeros mononucleados (Grupo controle - GC).
Indução ovulatória
O estímulo ovulatório empregado foi o regime de protocolo longo com bloqueio na fase lútea utilizando acetato de Leuprolide (Lupron - Abbott), seguido de FSH recombinante (rFSH, Puregon, Organon) em dose fixa (200 UI/dia ou 300 UI/dia, sem modificação da dose até o dia do hCG) ou dose variável (“step – down”).
Punção folicular e ICSI
A aspiração folicular por ultra-som transvaginal foi realizada 36 horas após a administração do 10.000 UI de hCG (Profasi-HP, Serono). Os oocitos recuperados foram analisados em estereomicroscópio e classificados de acordo com as características das células do complexo cumulus-corona (CCC). Em seguida, permaneceram em meio de incubação (IVF 20; IVF-Science) por quatro a cinco horas e, após este passo foram submetidos a ação da hialuronidase (Ryaluronidase type VIII; Sigma) para retirada do CCC. Classificou-se a maturidade nuclear de acordo com a morfologia oocitária, seguindo a classificação de Veeck (Veeck, 1998). Todos os oócitos em metáfase II foram injetados segundo técnica descrita por Palermo (Palermo et. al., 1992), não ultrapassando um período de seis horas entre a punção e a injeção. Os oócitos imaturos foram cultivados em meio de maturação (meio de crescimento acrescido de 0,075 UI/mL de FSH e 0,5 UI/ml de LH) e injetados logo após o seu amadurecimento nuclear. Os oócitos injetados foram cultivados até o terceiro dia de desenvolvimento em meio IVF sob óleo mineral em incubadora à temperatura de 37° C e 5% de CO2. A fertilização foi observada 16-20 horas após a injeção, considerando como fertilização normal aqueles oócitos que apresentaram 2 PN e 2 CP. Foram considerados embriões com fertilização anormal aqueles que apresentaram 2 PN com 1 CP, 1 PN com 2 CP, 1 PN com 1 CP e 3 PN. No segundo dia de desenvolvimento in vitro, foram observadas as características morfológicas e classificados como multinucleados àqueles embriões que apresentavam mais de um núcleo em um ou mais blastômeros.
Os resultados foram analisados estatisticamente através de teste “t” de Student com valores de p < 0.05 sendo considerados significativos.
Resultados
Foram estudados retrospectivamente 855 embriões dos quais 266 pertencem ao GBMN e 589, ao GC. Em 49 embriões foram observadas células multinucleadas, perfazendo 18,4% dos embriões do GBMN e 5,7% do total de embriões.
Quando comparou-se a idade das pacientes (34,3 ± 4,8 anos e 34,2 ± 5,8 anos), os níveis de estradiol (E2) no dia do hCG (2.988 ± 2.247 pg/mL e 2.496 ± 1.951 pg/ mL) e o número total de unidades de rFSH (2.492 ± 614 UI e 2.496 ± 646 UI), não houve diferença para os dois grupos estudados.
Com respeito ao número médio de folículos, oócitos, oócitos maduros (MII), número médio de oócitos fecundados (2 PN) e de embriões, os valores foram significativamente maiores para o GBMN (TABELA I). Porém, não houve diferença nas taxas de fecundação anormal, de implantação, de gravidez clínica e de aborto (clínico + pré-clínico), quando comparados os dois grupos (TABELA II).
TABELA I. Comparação do número médio de folículos, oocitos, MII, 2 PN e embriões entre o GBMN e GC.
TABELA II. Comparação das taxas de fecundação anormal, implantação, gestação e aborto entre o GBMN e GC.
Não houve diferenças significativas entre as taxas de oócitos imaturos (metáfase I + prófase) para os dois grupos (22% para o GBMN e 19,4% para o GC).
A relação entre o protocolo de indução e a prevalência de blastômeros multinucleados não diferiu entre os dois grupos. Quando se utilizou a dose fixa, a porcentagem de multinucleação para o GBMN foi de 43,75% e para o GC, 43,52%. Com a utilização de dose variável (“step-down”), 56,25% para o GBMN e 56,48% para o GC, respectivamente.
Discussão
Uma das maiores dificuldades dos laboratórios de embriologia são os parâmetros de seleção embrionária para transferência e criopreservação. Combinam–se várias análises não invasivas e de fácil realização, porém seu valor preditivo parece ser questionável (Scott et. al., 1991; Conaghan et. al., 1993).
A avaliação de multinucleação em blastômeros é mais um critério morfológico de seleção, uma vez que seu aparecimento é considerado um evento patológico, provavelmente causando aberrações cromossômicas significativas. Por esta razão, embriões contendo esta anormalidade são menos competentes e a transferência destes resulta em falha de desenvolvimento, sendo assim evitados para esta finalidade (Munné e Cohen, 1993; Kligman et. al., 1996).
A multinucleação em blastômeros de embriões humanos após a primeira divisão mitótica pode ter como origem mais de um mecanismo. Pode–se citar algumas possibilidades como a cariocinese na ausência de citocinese, resultando em anormalidades cromossômicas e/ou parada de clivagem (Hardy et. al., 1993). Pode ocorrer também uma fragmentação parcial do núcleo ou migração anormal dos cromossomos na anáfase mitótica (Lopata et. al., 1983; Tesarik et. al., 1987; Winston et. al., 1993), possivelmente induzida por mudanças na temperatura ou condições inadequadas de cultivo (temperatura, meio de cultura, etc) que provocariam um efeito deletério na função do citoesqueleto, mesmo antes da fertilização (Pickering et. al., 1995).
Estudos realizados por hibridização “in situ” por fluorescência (FISH) mostraram que 75% dos embriões contendo blastômeros multinucleados apresentavam anomalias cromossômicas contra 32% do grupo controle. Estas aberrações cromossômicas podem resultar em uma redução da taxa de clivagem como demonstrado em um estudo recente onde cultivou–se embriões multinucleados por 96-120 horas e 57% destes pararam a clivagem no estágio entre 2 e 15 células (Jackson et. al., 1998). Uma diminuição da taxa de clivagem consequentemente leva à diminuição das taxas de implantação e gravidez, fortalecendo a conduta da não transferência destes embriões, exceto em casos onde não existam outros embriões disponíveis para transferência.
Algumas observações mostram que a incidência de multinucleação é significativamente maior em embriões no estágio de duas células que em quatro células. Isto sugere que uma grande parte dos embriões humanos tornam–se anormais durante a primeira divisão mitótica, podendo ser consequência de uma maturação oocitária inadequada ou anormalidade na função espermática. Lembrando–se que o centrossomo do espermatozóide é o responsável pelo primeiro fuso mitótico, a sua presença e integridade são de suma importância para o processo de clivagem. Experimentos preliminares mostraram que distúrbios na estrutura espermática criados pela injeção intracitoplasmática de cabeças e caudas de espermatozóides mecanicamente isoladas induziram fertilização e clivagem normais porém o material cromossômico resultou em completa distribuição aneuplóide (Palermo et. al., 1994; Sultan et. al., 1995).
Uma nova análise morfológica está sendo somada aos demais critérios de seleção, a análise dos pronúcleos. Tesarik recentemente apresentou um estudo mostrando a relação de alguns pronúcleos irregulares e o aparecimento de multinucleação em blastômeros e, de acordo com o tipo de irregularidade pronuclear, estes números podiam alcançar valores 50% maiores que em embriões que apresentavam pronúcleos considerados normais e de bom prognóstico de implantação (Tesarik e Greco, 1999).
Em nosso estudo, a presença de embriões com BMN foi associada à pacientes que exibiram uma resposta mais exuberante à terapia com rFSH, refletida pelo maiorrecrutamento foliculare maior número de oócitos, apesar de níveis semelhantes de estradiol no dia do hCG. Baseado nestas observações, podemos especular que embriões com BMN são derivados de regimes de indução da ovulação onde os ovários são mais sensíveis à terapia com gonadotrofina e consequentemente, produzindo mais óvulo. Estudos anteriores confirmam o aparecimento de multinucleação em embriões de ciclos com respostas mais exuberantes à terapia de indução ovulatória, e relatam também menores taxas de implantação associadas à estes embriões (Forman et. al., 1988; Pellicer et. al., 1989). De acordo com nossos dados, a multinucleação esteve presente em 23% dos ciclos e em 5,7% de todos os embriões. Estes números são significantemente menores quando comparados a ciclos onde empregou–se como protocolo de estímulo FSH urinário ou ultra–puro (74% dos ciclos e 31% dos embriões) (Jackson et. al., 1998).
Ainda, a resposta mais exuberante, traduzida por um maior número de oócitos e embriões, levou a uma maior probabilidade de formação de embriões com multinucleação. Porém, esta maior resposta não foi acompanhada de alterações na qualidade da fecundação (taxas de fecundação anormal semelhantes nos dois grupos) e também não foi influenciada pelo regime de indução ovulatória empregado.
Estes dados nos permitem inferir que a multinucleação pode estar associada a uma hipersensibilidade de resposta ovariana e ser modulada pelo tipo de gonadotrofina empregada na indução ovulatória.
Também, no grupo de pacientes estudados, a presença ou transferência de, pelo menos, um embrião contendo blastômero multinucleado não interferiu na possibilidade de gestação destes casais.
Veeck L. L. – An atlas of human gametes and conceptuses. New York: Parthenon Publishing, 1998.