JBRA Assist. Reprod. 1999;03(02):25-31
RELATO DE CASO
doi: 10.5935/1518-0557.1999.3.2.08
Resumo
O propósito deste trabalho é relatar a ocorrência de uma gravidez tripla em programa de ICSI após transferência de embriões criopreservados pela técnica de congelamento ultra-rápido.
Unitermos: congelamento ultra-rápido, gestação tripla
Abstract
The purpose of this paper is to report a successful pregnancy stablishment of triples after transfer of embryos cryopreserved by an ultrarapid freezing technique protocol.
Keywords: Ultrarapid freezing, triple pregnancy
Introdução
Com o aumento da eficiência dos medicamentos de estimulação ovariana e uma política de redução no número de embriões transferidos, a criopreservação de embriões excedentes passou a ser um procedimento quase que obrigatório nos laboratórios de reprodução assistida. A despeito de longos anos de estudo da criopreservação de embriões (Trounson e Mohr, 1993) e das diversas técnicas descritas (Lassalle et al, 1985, Bongso et al, 1988) até pouco tempo atrás, as taxas de gravidez obtidas com transferência somente embriões que apresentassem clivagem 24 horas após descongelamento. Hoje em dia, as taxas de gravidez com embriões criopreservados variam mais em função do grupo de reprodução assistida do que em função da técnica utilizada.
Em vista do alto custo dos equipamentos de congelamento tradicionais (como a congeladora Planner) e sua manutenção, nossa equipe optou pela técnica de congelamento ultra-rápido descrita por Trounson (1987) e modificada por Franco Jr. e colaboradores (1997).
Este trabalho tem como objetivo relatar o sucesso no estabelecimento da primeira gravidez com embriões criopreservados da Clinimater.
Materiais e Métodos
Paciente, A.M.Z., 26 anos, com um filho de 4 anos, resultado de uma inseminação heteróloga e seu marido S.Z., 57 anos, azoospérmico, procuraram a Clinimater em julho de 1998 desejando uma segunda gravidez. A paciente foi estimulada usando-se um protocolo longo, ou seja, bloqueio prévio com análogo de GnRH (Lupron, Abbott) e estímulo com FSH purificado (Metrodin HP-Serono) em “step-down” (300 UI até o 6° dia e 150 UI do 7° ao 12° dia). Quando dois folículos ou mais apresentaram 17mm, foi administrado hCG 10.000UI (Profasi, Serono), após 34 horas, a paciente foi sedada com propof ol (Diprivan, Zeneca) e realizouse a aspiração folicular utilizando-se agulha de aspiração da Cook de 17G 28cm acoplada a aspirador (Olidef), monitorada por aparelho de ultra-som transvaginal (Hitachi). Foram identificados 15 oócitos e após a remoção do cumulus-oophorus com 80U de Hyaluronidase (Hyase, Scandinavian) constatou-se que 13 estavam em metáfase II (MII). O marido, também sedado com propof ol, foi submetido ‘a biópsia testicular e como não foram encontrados espermatozóides, o casal optou por sêmen de doador. Os oócitos maduros (M II) foram colocados em gotas de 5μl de meio tamponado Gamete (Scandinavian) coberto com óleo mineral (Sigma) e então injetados usando-se um microscópio Nikon-Diaphot 100, micromanipuladores e microin jetores Narishige e micropipetas COOK (Austrália). Após a injeção os oócitos foram incubados em meio IVF 50 (Scandinavian, Suecia) com 10% de soro sintético substituto (SSS, Irvine) coberto com óleo mineral. Observou-se 18 horas após a injeção que 12 oócitos apresentaram 2 pronúcleos e foram transferidos para nova placa de cultura contendo meio P1 (Irvine, USA) coberto com óleo mineral. No 3° dia após a injeção intracitoplasmática de espermatozóides, com auxílio de um cateter Frydman 4,5cm, foram transferidos 4 embriões tipo I (embriões com 6 a 8 células, blastômeros regulares e sem fragmentação (Veek, 1991). O suporte da fase lútea foi feito com a administração IM diária de 100mg de progesterona oleosa iniciada no dia da aspiração folicular. Os embriões excedentes foram congelados pela técnica de congelamento ultra-rápido. Após 15 dias da transferência de embriões, a paciente fez uma dosagem qualitativa de ß-HCG urinário, sendo o resultado negativo para gravidez. Três meses após a transferência, a paciente retornou para receber os embriões criopreservados. O preparo do endométrio foi feito pela administração de 2mg de estradiol (Estrace) iniciado no 3° dia do ciclo natural, aumentando-se a dosagem até que, ao exame de ultra-som transvaginal o endométrio apresentasse uma espessura mínima de 7mm. A administração de progesterona injetável, na dose de 100mg/dia, iniciou-se dois dias antes da transferência. Os embriões foram então descongelados em etapas, transferidos para meio de cultura P1 coberto com óleo mineral e deixados em cultura por 24h. No dia seguinte avaliou-se sua vitalidade checando-se a ocorrência de clivagem. Cinco embriões clivaram e foram colocados em gotas de 5μl de meio tamponado Gamete (Scandinavian, Suécia) coberto com óleo mineral, e, com auxílio de micromanipuladores e micropipetas (Humagen, USA), foi realizado “hatching” químico com ácido Tyrode (Irvine, USA) pH 2,5. Os embriões foram lavados em meio fresco P1 e deixados em cultura até o momento da transferência. Foram transferidos 5 embriões do tipo I seguindo o mesmo protocolo para embriões ‘a fresco, inclusive o suporte da fase lútea.
Após 15 dias da transferência de embriões, a paciente fez uma dosagem qualitativa de ß-HCG urinário sendo o resultado positivo para gravidez. Ultra-sonografia transvaginal realizada após duas semanas revelou a presença de 4 sacos gestacionais, sendo 3 com batimentos cardíacos. Após 2 semanas um dos 3 embriões parou o crescimento e começou a involuir. Até o momento da redação deste trabalho os dois fetos restantes apresentavam-se saudáveis e a gestação de 34 semanas prosseguia sem problemas.
Congelamento ultra-rápido
A solução de congelamento foi preparada adicionandose 1,065ml de DMSO (Sigma) ‘a 3,935ml de meio IVF 50 + 10% SSS (solução 1). Nessa solução foram acrescentados 0,4278g de sucrose (Sigma) (solução 2). A solução 2 foi filtrada (0.22μm) e estocada a 4°C até o momento de ser utilizada.
Os embriões excedentes foram colocados em solução de congelamento em temperatura ambiente por 2 minutos e 30 segundos. Durante esse tempo, foram aspirados para dentro de uma palheta de 0,25ml identificada com o nome da paciente, selada em ambas as extremidades e então mergulhada diretamente em nitrogênio líquido.
Descongelamento em etapas
A solução de descongelamento foi preparada adicionando-se 0,4278g de sucrose ‘a 5ml de meio IVF 50 + 10% SSS (solução A). Esta solução foi usada para se preparar as três solucões de diluição:
Sol. 1 – 2ml de sol. A + 1ml de meio IVF 10% SSSApós filtragem (0,22um) as soluções foram deixadas em temperatura ambiente. A palheta contendo os embriões foi retirada do nitrogênio líquido e agitada em banho maria ‘a 37°C por 15 segundos. Os embriões então foram expulsos da palheta para dentro da solução A. Em seguida foram transferidos para solução 1 onde ficaram por 10 minutos, depois para a solução 2, 10 minutos, solução 3, 10 minutos e finalmente no meio P1 onde foram cultivados por 24hs antes de serem avaliados para continuidade da clivagem.
Sol. 2 – 1ml de sol. A + 1ml de meio IVF 10% SSS
Sol. 3 – 1ml de sol. A + 2ml de meio IVF 10% SSS
Discussão
A preocupação com o destino de embriões excedentes vem sendo registrada há muito tempo. Trouson e col. (1987) relataram uma técnica de congelamento ultra-rápido onde, além da preocupação com a preservação dos embriões levantou-se a questão do custo do procedimento. Equipamentos de congelamento, como a congeladora Planner são extremamente caros, assim como sua manutenção e consumo de nitrogênio líquido. Petersen e col. relataram em 1997 taxas de gravidez por transferência embrionária de até 31,8% quando utilizaram a técnica de Trouson modificada.
Em vista destes dados animadores, nosso grupo optou pela utilização do mesmo procedimento e tão logo os ajustes na técnica foram feitos, pudemos constatar nossa primeira gravidez com embriões descongelados. Acreditamos que a técnica de congelamento ultra-rápido de embriões desenvolvida por Trouson e modificada por Petersen e col. é uma opção válida para grupos de reprodução assistida que estejam iniciando suas atividades ou cujos recursos econômicos estejam temporariamente limitados.