JBRA Assist. Reprod. 1999;03(03):33-35
RELATO DE CASO
doi: 10.5935/1518-0557.1999.3.3.07
Preservação de folículos primordiais por técnica de congelamento de fragmentos de córtex ovariano
Preservation of primordial follicles by freezing ovarian cortex fragments
Resumo
A combinação de quimio e radioterapia fez melhorar consideravelmente a sobrevivência de pacientes jovens portadoras de câncer. No entanto, estas pacientes estão em alto risco de desenvolver menopausa prematura devido à alta toxicidade destes agentes terapêuticos para as gônadas. A criopreservação de tecido cortical ovariano é uma técnica recentemente sugerida para a preservação da fertilidade feminina. Uma vez estocado o material inúmeras possibilidades existem para o seu uso. Foram criopreservados fragmentos de córtex ovariana de três pacientes usando-se o etileno glicol a 1,5M como crioprtetor Amostras do tecido foram enviadas para anátomo-patológico comparativo a fresco e após descongelamento. O material foi bem preservado, apresentando aspecto idêntico ao material fresco. A técnica de criopreservação de córtex ovariano é relativamente simples. Em pacientes oncológicas jovens com boas chances de completa remissão, oferece a oportunidade de reverter a esterilidade iatrogênica causada pela quimio e radioterapia. Em pacientes saudáveis, oferece possibilidade de gerar filhos mesmo após a menopausa.
Unitermos: ovário, criopreservação, reprodução assistida
Abstract
The combination of chemo and radiotherapy has improved the survival of young patients with cancer, but these patients are at a great risk of developing premature menopause due to the high gonadal toxicity of the therapeutic agents. The cryopreservation of ovarian cortex is a new option for the preservation of their fertility. Once the material is frozen and stored, many possibilities exists for its future use. Three patients had their ovarian cortex fragments cryopreserved using ethylene glycol 1,5M as a cryoprotectant. Fresh and frozen-thawed samples were compared microscopically. The tissue was identical in fresh and frozen thawed samples, well preserved. The technique of cryopreservation is relatively simple. In young oncologic patients with good chances of complete remission it offers the oportunity to revert the iatrogenic sterility caused by chemo and radiotherapy. In healthy patients, it offers the possibility of pregnancy even after menopause.
Keywords: ovary, cryopreservation, assisted reproduction
Introdução
As primeiras tentativas em se congelar tecido ovariano datam dos anos 50 em Londres. O tecido ovariano de camundongos e ratos foram congelados a -79°C em salina-glicerol, descongelados e enxertados em animais ooforectomizados. Foi observada presença de produção de estrogênio, mas a fertilidade não foi testada. Num outro experimento, camundongos congênitos receberam transplantes de ovário e geraram filhotes, mesmb que em pequenas ninhadas, como prova do princípio de conservação da fertilidade (Nugent et al., 1997).
Foram então mais de 30 anos sem que o tema despertasse interesse ou pesquisa, muito embora a criotecnologia se desenvolvesse bastante, assim como melhores crioprotetores e novos “freezers” automáticos. As novas técnicas foram aplicadas em tecido ovariano de camundongo e se mostraram eficientes para a restauração da fertilidade. Os experimentos se iniciaram em ovelhas, devido a maior semelhança entre o tecido ovariano destas e o humano em tamanho, composição e densidade folicular. Os ovários foram removidos por laparotomia e transplantados frescos ou após descongelamento. A fertilidade foi conservada, as ovelhas produziram filhotes. Um outro estudo mostrou produção hormonal cíclica normal nos animais.
A camada cortical (1 mm - 2 mm) do ovário humano foi preservada com sucesso em vários crioprotetores e implantada nas cápsulas renais de camundongos imunodeprimidos, apresentando aspecto histológico normal. O crioprotetor que resultava em maior sobrevivência folicular foi o etileno glicol (84%) e a menor sobrevivência folicular foi observada usandose glicerol (10%) (Newton et al., 1996; Newton et al., 1998).
O uso clínico da técnica da preservação ovariana teria principalmente dois objetivos: preservação de folículos primordiais dos efeitos deletérios do envelhecimento e proteção dos folículos em períodos adversos, como, por exemplo, radio e quimioterapia. A combinação de quimio e radioterapia fez melhorar consideravelmente a sobrevivência de pacientes jovens portadoras de câncer. Estas pacientes, entretanto, estão em alto risco de desenvolver menopausa prematura, especialmente após tratamentos com altas doses. Estes agentes terapêuticos se mostraram altamente tóxicos às gônadas. O ovário humano é muito sensível á radioterapia, apresentando LD50 de 4 Gy, o que está nos limites das doses terapêuticas.
Um estudo recente mostrou que 48% das pacientes com câncer apresentaram falência ovariana após tratamento com radio e quimioterapia. Após transplante de medula óssea 92% das pacientes jovens com câncer (idade média 29 anos) apresentavam falência ovariana como demonstrado pelos níveis de gonadotrofinas e ciclos menstruais. A avaliação histológica dos ovários das pacientes depois do tratamento demonstrou atrofia ovariana e diminuição das reservas foliculares, mesmo naquelas que menstruavam regularmente. Crianças e adolescentes são mais resistentes, provavelmente devido à sua maior reserva ovariana.
O uso da doação de óvulos é o tratamento mais comum para as pacientes curadas esterilizadas pela radio-quimioterapia. Atualmente, as outras opções seriam a tentativa de preservar a fertilidade antes do tratamento através da criopreservação de ovócitos, embriões, ou mais recentemente, o tecido ovariano.
A técnica de congelamento de ovócitos tem apresentado resultados limitados, sendo os relatos de gestações obtidas após descongelamento, raros. Já o congelamento de embriões estaria restrito à pacientes com parceiro fixo, o que não é o caso da maioria das jovens no início de sua vida reprodutiva.
A criopreservação do tecido ovariano se torou uma técnica promissora para a proteção da fertilidade. A sua mais idealizada aplicação seria o transplante do córtex ovariano para restaurar a aparência fenotípica e a produção cíclica de óvulos. Desta forma, mulheres poderiam adiar a maternidade para mais tarde, num momento da vida mais oportuno, com a segurança de ter seus óvulos resguardados pela técnica do congelamento.
O tecido criopreservado poderá ser usado de várias maneiras: em transplante ortotópico, heterotópico ou através de cultivo e maturação in vitro dos folículos primordiais do tecido congelado para a obtenção de ovócitos maduros para a fertilização in vitro com transferência de embriões. Esta técnica seria de importante utilidade naquelas pacientes nas quais há risco de transplante de tecido metastático maligno pelo córtex ovariano (Oktay et al. 1997).
A seguir será feita a descrição dos primeiros 3 casos de congelamento de tecido ovariano realizado nesta clínica.
Descrição dos casos
Caso 1
Neste relato, o córtex ovariano do ovário esquerdo da paciente W. M. F. S., 29 anos, portadora de câncer de colo uterino, foi removido na ocasião da histerectomia e criopreservado para a preservação dos folículos primordiais anteriormente à irradiação terapêutica.
O tecido foi transportado até o laboratório (20 min) e imediatamente dissecado em placa de Petri (Falcon). A camada cortical foi cuidadosamente removida e lavada em solução salina gelada (4°C). O tecido foi dividido em vários fragmentos de 1,0-1,5 cm por 0,2-0,3 cm de espessura. Todo o procedimento foi realizado sob fluxo laminar e em condições estéreis. Um fragmento foi fixado para exame anátomo-patológico. Os outros fragmentos foram imersos na solução de congelamento (meio de cultura tamponado pH 7,2-7,4, 1,5M etileno glicol, 4mg BSA, fração V, sacarose 1,0M, gentamicina e anfotericina B) e mantidos com agitação a 4°C por 30 mino Os fragmentos foram acondicionados em tubos para congelamento (Sigma) de 1,8 ml e colocados num “freezer” Biocool II (MTS Systems) com solução cryocool Savant e congelado à taxa de 2,0°C/min até −9°C, quando foi feito seeding com spray. O tecido foi resfriado de −9°C até −40°C, 0,3°C/min e o tubo armazenado no nitrogênio líquido.
Uma amostra foi descongelada por agitação em banho Maria a 25°C. O crioprotetor foi removido por imersão em solução 50% meio de congelamento/50% meio M2 por 10 min e em meio M2 puro por 30 mino O fragmento foi fixado e enviado para exame anátomo-patológico comparativo com a amostra pré-congelamento. O exame mostrou fragmentos de córtex ovariano com arquitetura preservada, com vários folículos primordiais (em tomo de 48). Os fragmentos pré e pós congelamento apresentaram aspecto histológico idênticos (foto I).
Foto I. Aspecto histológico normal do córtex ovariano após descongelamento. Os folículos primordiais estão bem preservados, assim como o tecido conjuntivo adjacente (HE-250x).
Caso 2
Paciente, T. P., 33 anos, solteira. Foram congelados fragmentos do córtex ovariano para preservação de sua fertilidade.
Parte do ovário esquerdo da paciente foi removido por laparoscopia (Meirow et al., 1999). Foi imediatamente imersa num tubo contendo meio M2 (Sigma) no gelo (−4°C) e entregue ao laboratório. O processo de congelamento foi idêntico ao previamente descrito. Após 20 dias, uma amostra foi descongelada e enviada para anátomo-patológico.
Caso 3
A paciente S. G., 24 anos, solteira, apresentando leucemia megaloblástica, foi submetida a laparoscopia para remoção de fragmento ovariano para criopreservação antes do início da quimioterapia. O material foi manipulado como anteriormente descrito. O exame anátomo-patológico da amostra mostrou boa conservação tecidual após descongelamento.
As amostras restantes serão mantidas em nitrogênio líquido até que as pacientes manifestem desejo em procriar ou manter secreção endógena hormonal natural pela reimplantação dos fragmentos ovarianos criopreservados.
Discussão
A criopreservação de tecido cortical ovariano é uma técnica recentemente sugerida para a preservação da fertilidade feminina. Uma vez estocado o material inúmeras possibilidades existem para o seu uso.
No momento, vários centros em todo mundo desenvolvem pesquisa envolvendo a maturação in vitro de ovócitos imaturos. É só uma breve questão de tempo, e serão consolidados protocolos que possibilitarão a obtenção de ovócitos maduros para serem fertilizados in vitro a partir do tecido humano fresco, como já acontece em bovinos.
A técnica de criopreservação de córtex ovariano é relativamente simples. Em pacientes oncológicas jovens com boas chances de completa remissão, oferece a oportunidade de reverter a esterilidade iatrogênica causada pela quimio e radioterapia. Em pacientes saudáveis, oferece possibilidade de gerar filhos mesmo após a menopausa.