JBRA Assist. Reprod. 2000;04(01):7-10
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2000.4.1.02
1ORIGEN - Centro de Medicina Reprodutiva
2Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina da UFMG
Resumo
A doação de óvulos (OD) é um método estabelecido de reprodução assistida para mulheres com infertilidade irreversível efalhas prévias de implantação após FIV Apesar das taxas de gestação serem bastante elevadas, por vezes a implantação pode não ocorrer mesmo após diversas tentativas. Neste estudo, descreveu-se os doisprimeiros casos de tranferência de blastocistos sem zona pelúcida, que se desenvolveram em gestações normais e nascimentos. As pacientes haviam sido submetidas a 3 tentativas prévias de doação de óvulos com falha de implantação. O preparo endometrial foi realizado após s upressão da função hipofisária, com valerato de estradiol e progesterona. Os embriões normalmentefertilizadosforam cultivados em meio de Earle até o dia 3 e, em meio S2 até o dia 5. Para cada paciente, a zona pelúcida de 2 blastocistos expandidos foi enzimaticamente removida com pronase. Os blastocistos sem a zona pelúcida foram posteriormente transferidos. No 12º dia após a transferência, as gestações foram confirmadas através da dosagem dos níveis séricos de β-hCG. Um saco gestacional com batimento cardíaco foi visto ao ultra-som 15 dias depois, em cadapaciente. Crianças normais nasceram porparto cesárea com 38 e 39 semanas de gestação. Este é o primeiro relato na literatura de gestações e nascimentos após doação de óvulos e transferência de blastocistos sem zona pelúcida. Nosso estudo demonstra não apenas a capacidade de realização do procedimento, mas também abre uma nova alternativa para pacientes com repetidas falhas de implantação após ciclos de OD. Mais ainda, esta técnica poderá aumentar ainda mais as taxas de sucesso em ciclos de doação de óvulos.
Unitermos: blastocistos, zona pelúcida, doação de óvulos
Abstract
Oocyte donation (OD) is a well established method of assisted reproduction for women with irreversibly infertility and with previous implantation failures after IV F. Although the pregnancy rates are very high, sometimes implantation does not occur even after various attempts. We report the first two cases of transfer of zona free blastocysts in oocyte donation cycles that developed to normal pregnancies and births. The patients had undergone three previous standard oocyte donation cycles with failure of implantation. Endometrium preparation was performed after suppression of the pituitary function , with estradiol valerate and progesterone at the day of oocyte retrieval. Normally fertilized embryos were cultured in Earle's culture medium until day 3 and in S2 medium until day 5. For each patient, the zonae of two fully expanded blastocysts were enzymatically removed with 0.5% pronase. Zona free blastocysts were transferred for the patients 2 hours later. On day 12 after transfer, pregnancies were confirmed with elevated serum levels of ß-hCG. A gestacional sac with a fetal heart beat was seen by ultrasound 15 days later, in each patient. Normal healthy babies were bom at 38 and 39 weeks of pregnancy, respectively. This is the first report of successful pregnancies and births after oocyte donation and transfer of zona free blastocysts in humano It shows not only the feasibility of the treatment but also, opens a new altemative for the patients with repetitive implantation failure after OD cycles.
Key words: blastocysts, zona free, oocyte donation
Introdução
A técnica de reprodução assistida por doação de óvulos (OD) representa um método bem definido utilizado em mulheres com infertilidade irreversível por ausência ou falência ovariana. Oesde as primeiras publicações (Lutjen et al., 1984) diversos casais tem obtido gestações por todo mundo utilizando-se desta técnica. A primeira indicação para OD foi a falência prematura ovariana , subse qüentemente , as indicações se expandiram para menopausa fisiológica, pacientes má respondedoras ao hiperestímulo ovariano para fertilização "in vitro" (FIV) e falhas repetidas de implantação após FIY. Neste último caso, OD representa a última oportunidade de obter uma gestação.
As taxas de gravidez em ciclos de OD são bastante elevadas, sendo que os resultados na literatura giram em torno de 50% por ciclo (Remohi et al., 1997). O principal motivo para estes resultados é a idade das doadoras , que geralmente são inferiores a 30 anos. Assim, diversas mulheres que não conseguiram obter uma gestação com seus próprios oócitos podem se beneficiar com esta técnica com chance superior de obter uma gestação. Em alguns casos , entretanto , a implantação não ocorre, mesmo após diversas tentativas em ciclos de OD. Nestes casos, é importante apresentar outras alternativas para os casais que tiveram repetidas e frustradas tentativas de implantação, seja com os próprios oócitos ou com oócitos doados. Até o momento poucos avanços e alternativas tem sido apresentados na literatura, para pacientes com maus resultados em ciclos de OD.
Apesar do fenômeno de hatching ser essencial para a implantação embrionária, o verdadeiro mecanismo e sua incidência "in vivo" persiste desconhecida. As taxas de "hatching" dos blastocistos "in vitro" variam , na literatura, de 10% (Hardy et al. , 1989) a 20% (Lopata & Hay, 1989). Aparentemente, o endométrio tem ação importante no processo de hatching, aumentando a incidência e melhorando as taxas de implantação. Desta forma, podemos inferir que as falhas de implantação podem ser relacionadas às dificuldades dos blastocistos em extruir da zona pelúcida "in vivo", devido a fator endometrial e não embrionário.
Recentemente, uma gestação normal foi descrita após transferência de blastocistos sem zona pelúcida em ciclo de FIV (Fong et al., 1997), após 8 falhas de implantação em ciclos de FIV clássico. Os autores sugeriram que a remoção da zona pelúcida pudesse aumentar as taxas de gestação em ciclos de FIV, como consequência de uma melhor implantação. Nosso estudo descreve os primeiros casos na literatura mundial, de gestação após transferência de blastocistos que tiveram a zona pelúcida removida, em ciclos de doação de óvulos, devido a falhas anteriores de implantação em ciclos de doação de óvulos com transferência de embriões no dia 3.
Material e Métodos
Os dois casais descritos foram indicados para OD devido a 4 falhas de implantação em ciclos de F IV convencional. As pacientes tinham 40 e 41 anos de idade com ciclos menstruais regulares de 28 dias, nos últimos 10 anos. A propedêutica da infertilidade demonstrou perfil hormonal normal, assim como a avaliação das trompas e endométrio. A avaliação seminal estava dentro dos critérios de normalidade. Após mais 3 falhas de implantação, desta vez em ciclos de OD, os casais concordaram em proceder transferência de embriões em estágio de blastocisto após remoção da zona pelúcida, com oócitos doados.
Preparo Endometrial
Em ambas as pacientes, o tratamento foi iniciado no 2° dia do ciclo com a administração de 3,6 mg do análogo do GnRH (Goserelin, Zoladex, Zeneca) por via subcutânea, para supressão da função hipofisária. Para confirmar a supressão, foi realizado dosagem dos níveis de estradiol (E2) sérico e ultra-sonografia endovaginal (Tosbee - Toshiba - Japan), 10 dias após a injeção. Como os níveis de estradiol encontravam-se 30 pg/ml e o ultra-som apresentou espessura endometrial inferior a 3 mm, as pacientes foram consideradas prontas para iniciar o tratamento.
O preparo endometrial foi realizado utilizando reposição hormonal para mimetizar o ciclo natural. Inicialmente usamos valerato de estradiol (Climene, Schering, Brasil) para induzir maturação endometrial através da administração de 2 mg ao dia, do dia 1 ao dia 5; 4 mg do dia 6 ao 10; e 6 m1/g por dia à partir do dia 11. Após 16 dias as pacientes eram consideradas prontas para a transferência de embriões se os níveis de estradiol fossem superiores a 300 pg/ml e o uitra som apresentasse uma espessura endometrial 28 mm. No dia da aspiração folicular, as pacientes iniciaram com 100 mg de progesterona intramuscular ao dia.
FIV, desenvolvimento embrionário e remoção da zona pelúcida
Os oócitos de cada paciente foram inseminados 5 horas após a punção folicular com 50.000 espermatozóides móveis/oócito, em gotas de 20 μl de meio de Earle (SIGMA - USA) e 10% de soro substituto (Irvine - USA), e incubados a 37°C a 5% de CO2. O preparo do sêmen foi feito pela técnica de "swim -up". No dia seguinte à inseminação, 17-19 horas após (dia 1), a fertilização foi confirmada pela presença de dois pronúcleos.
Os embriões foram cultivados em gotas de 20 μl of Earle com 10% de soro substituto a 37°C em placa de Petri (Falcon - BD - USA), até o dia 3. Neste dia, os embriões foram então transferidos para gotas de meio S2 (Scandinavia IV F, Suécia) até o dia 5.
Para cada paciente a zona pelúcida dos blastocistos expandidos selecionados foi enzimaticamente removida com 0 ,5% de pronase em meio de Earle. Os blastocistos sem a zona pelúcida foram então reincubados em meio S2 até o momento da transferência.
Resultados
Um total de 8 oócitos foram doados para cada paciente, e 7 e 6 foram fertilizados, respectivamente. No dia 3 após a inseminação, cinco embriões de 8 células foram observados para cada paciente. Dois dias após, 3 embriões se desenvolveram em blastocistos expandidos, em uma paciente, e 2 embriões na outra paciente. A zona pelúcida de 2 blastocistos foi então removida enzimaticamente para cada paciente, sem danos para os embriões. Ambos embriões foram transferidos em 10µl de meio S2 com 30% de soro substituto, utilizando cateter de Frydman (CCD - França), e guiado por ultra som (Tosbee - Toshiba - Japão), conforme atuamos rotineiramente.
Doze dia após a transferência, as gestações foram confirmadas através dos elevados níveis de ß-HCG. A presença de um saco gestacional foi identificada em cada paciente 15 dias após, através da ultrasonografia endovaginal. A reposição hormonal foi mantida até a 12a semana de gestação. Em ambos os casos, os partos foram por via abdominal com 38 e 39 semanas de gestação e fetos sadios.
Discussão
As taxas de sucesso com tratamento de doação de óvulos para falhas seguidas de implantação após FIV tem sido descritas e repetidas durante os últimos anos. De fato, Remohi et al. (1997) demonstraram uma taxa acumulada de gestação de 95% e de parto de 89%, independente da causa de infertilidade ou da idade da paciente. Apesar destes resultados se apresentarem bastante elevados, algumas vezes nos deparamos com falhas repetidas de implantação que ocorrem mesmo após ciclos de OD, com diferentes doadoras. Para estas pacientes a única opção, até o momento é continuar insistindo em ciclos de doação de óvulos até que a gestação ocorra.
Desde o desenvolvimento dos meios de cultura sequenciais (Gardner et al, 1998) a transferência de embriões no estágio de blastocistos surgiu como uma alternativa para a transferência rotineira no dia 3. Os resultado iniciais são bastante promissores com elevadas taxas de gestação. A transferência de embriões em estágio mais tardio pode aumentar as taxas de implantação devido a um maior sincronismo com a receptividade endometrial, além de melhorar nosso critério de seleção para transferência.
A zona pelúcida aparenta ter um papel importante na fertilização, prevenindo a dispersão dos blastômeros e impedindo o contato dos blastômeros com células estranhas (Bleil & Wassarman, 1980). Entretanto, para que ocorra a implantação, é essencial que o blastocisto passe pelo mecanismo de "hatching" ou extrusão da zona pelúcida. Os mecanismos de "hatching" não estão ainda desvendados, sendo também possível que o endométrio exerça um papel neste processo. Portanto podemos assumir que repetidas falhas de implantação podem estar relacionadas com a dificuldade dos blastocistos em extruir da zona pelúcida, "in vivo", que pode ser por um fator endometrial e não embrionário. A descrição de uma gestação normal obtida após transferência de blastocistos após remoção da zona pelúcida (Fong et al., 1997) abriu uma nova alternativa para pacientes com falhas seguidas de implantação. A remoção da zona pelúcida antes da transferência de blastocistos pode melhorar o processo de implantação, especialmente nos casos em que o endométrio é provavelmente o responsável pela ausência do "hatching".
Em nosso estudo, descrevemos dois casos em que as pacientes haviam se submetido anteriormente a 3 ciclos de OD com diferentes doadoras. Como os embriões obtidos se desenvolveram a partir de diferentes fontes de oócitos. Assim, decidimos transferir os embriões em estágio de blastocistos, e sem a zona pelúcida. As gestações obtidas podem demonstrar que o endométrio tem participação importante no processo de "hatching". Este é o primeiro relato de gestações e nascimentos após ciclos de doação de óvulos e transferência de blastocistos sem a zona pelúcida, em humanos. Nosso estudo demonstra não apenas a capacidade de realização do procedimento, mas também abre uma nova alternativa para pacientes com repetidas falhas de implantação após ciclos de OD. Além disso, esta técnica poderá aumentar ainda mais as taxas de sucesso em ciclos de doação de óvulos.