JBRA Assist. Reprod. 2000;04(01):11-18
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2000.4.1.03
Influência das características do sêmen sobre os resultados de fertilização "in vitro"
The influence of semen characteristics on the results of fertilization "in vitro"
Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Departamento de Tocoginecologia - Ambulatório de Esterilidade Conjugal
Resumo
Estefoi um estudo clínico descritivo, com o objetivo de avaliar a influência de alguns parâmetros espermáticos e o número de óvulos maduros, sobre a fertilização "in vitro " em humanos. Analisaram-se 98 amostras de sêmen e 678 oócitos de casais atendidos no Ambulatório de Esterilidade Conjugal do Departamento de Tocoginecologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas. Na análise dos dados, a variável dependente foi a ocorrência ou não de fertilização do oócito "in vitro " ea taxa defertilização "in vitro ". Constatou-se que as variáveis de maior influência na fertilização do oócito "in vitro "foram: a motilidade grau A e o número de óvulos maduros. Dados obtidos através da curva ROC mostraram que o ponto de corte para porcen tagem de espermatozóides com motilidade do grau A, foi ≥30/<30, cujos valores de sensibilidade e especificidade foram de 65,2% e 65, 5%, respectivamente. Baseando-se neste valores, estima-se que a probabilidade de ocorrer fertilização, quando a porcentagem de espermatozóides móveis do grau A for superior a 30%, é de 1,89.
Unitermos: fertilização "in vitro", espermatozóide, morfologia espermática, motilidade espermática, taxa de fertilização "in vitro".
Abstract
The objective of this descriptive clinical study was to evaluate whether some spermatic parameters and number of mature oocytes, have influence with regards of fertilization "in vitro" of human gametes. Ninety eight samples of semen and 678 oocytes of couples, attended at the Infertility Clinic of Unicamp, were analyzed. For the data analysis, the dependent variable were the occurrence or not of fertilization of the oocyte "in vitro" and the rate of fertilization "in vitro". The variables with greater influence in the fertilization of the oocyte "in vitro" were: grade A motility and the amount of mature oocytes. Data obtained from the ROC curve showed that the cut point for the percentage of spermatozoa with grade A motility was >30/<30, with sensitivity and specificity values at 65.2% and 65.5% respectively. Based on these values, the odds for fertilization, when the percentage of motile grade A spennatozoa is greater than 30%, was 1.89.
Key Words: "in vitro" fertilization, spermatozoa, motility spermatic, morphology spermatic, rate of fertilization.
Introdução
De acordo com vários estudos o fator masculino está presente em 25 a 40% dos casais inférteis (Spira & Multigner, 1998), o que toma obrigatória a avaliação clínica do homem em todo casal com problemas de fertilidade. O estudo do sêmen deve ser considerado como o elemento mais importante na apreciação de uma infertilidade masculina. Um espermograma pode evidenciar uma ou várias anormalidades, incluindo baixa concentração de espermatozóides (oligospermia), distúrbios na motilidade (astenospermia), grande proporção de formas anormais (teratospermia), ou alta taxa de mortalidade (necrospermia).
Somente após o ano de 1928 o número de espermatozóides foi associado ao potencial de fertilidade. Desde então, uma variedade de testes espermáticos e parâmetros do sêmen vêm sendo desenvolvidos e avaliados, na esperança de esclarecer se um detenninado homem pode ou não fecundar sua parceira. A análise espermática tradicional, que inclui avaliação da concentração, vitalidade e morfologia do espermatozóide não determina diagnóstico ou prognóstico preciso da capacidade de fertilização "in vivo" ou "in vitro" (Aitken et al., 1982). Muitos homens avaliados por problemas de fertilidade têm oligospermia, assim como motilidade e morfologias alteradas, geralmente em combinação. Outros fatores conhecidos e desconhecidos, incluindo ainda os fatores femininos, são também importantes durante o processo da fertilização e devem ser sempre considerados. Muitos casais concebem, apesar de um espennograma anonnal. Atualmente, nenhum teste de função espennática pode predizer completamente a fertilidade, exceto onde existe uma desordem absoluta, como a azoospermia ou ausência total de acrossoma. Portanto, é necessário evidenciar quais grupos de testes espermáticos permitem a melhor infonnação sobre fertilidade e são úteis para predizer a capacidade fertilizante do espermatozóide. Este tipo de informação é de grande importância no aconselhamento de casais tanto na conduta clínica quanto na utilização da técnica de fertilização "in vitro" mais indicada.
Os objetivos do estudo foram avaliar a influência de algumas características do sêmen e oócitos sobre a fertilização "in vitro" em humanos e quais as variáveis de maior influência na probabilidade de fertilizar.
Casuística e Métodos
Neste estudo clínico descritivo foram analisadas 98 amostras de sêmen e 678 oócitos de casais atendidos no Ambulatório de Esterilidade Conjugal do Departamento de Tocoginecologia, Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da UNICAM P, participantes do programa de FIV do CAISM/UNICAMP, no período de 1992 à 1995.
Como critérios de inclusão foram considerados as amostras de sêmen que apresentavam, após o processo de capacitação, recuperação superior a 1 x 10G/ml espermatozóides e oócitos provenientes de mulheres inscritas no Programa de FIV da UNICAMP, apresentando idade inferior a 38 anos. Foram excluídas as amostras de sêmen que apresentavam cultura positiva para microorganismos. Como variáveis dependentes foram consideradas a presença ou ausência de fertilização "in vitro" e a taxa de fertilização. Como independentes as características espermáticas e dos oócitos.
As amostras de sêmen foram coletadas por masturbação, após um período de três a cinco dias de abstinência sexual. Os óvulos foram recuperados, após indução da ovulação, através de punção por via transvaginal sob visão ecográfica. Os óvulos foram classificados em maduros ou imaturos, respectivamente, segundo a presença ou não de corpúsculo polar (Veeck, 1990).
As amostras de sêmen foram analisadas de acordo com as normas da Organização Mundial de Saúde (WHO, 1992) e tratadas com a técnica de Percoll (Guerin et al. 1989).
Após a punção folicular, cada oócito foi incubado em 0,9ml de meio de cultura (Ham F-10 + 30% de soro fetal). Um total de 50 a 100mil espermatozóides, previamente capacitados, foi acrescentado para cada solução contendo um oócito. Os gametas foram incubados em estufa com atmosfera de C02 a 5% (Forma Scientific, USA). As células do "cumulus oophorus" foram removidas 16 a 20 horas após a insemini ação, para determinar a presença do pronúcleo masculino e o número de corpúsculos polares. O critério de fertilização foi dado pela presença de dois pronúcleos e posterior surgimento de clivagem (Trounson et al., 1982).
Análise estatística
As variáveis referentes às característicasdas amostras de sêmen foram descritas através de suas medianas, com seus respectivos erros-padrão estimados segundo o método bootstrap (Efron & Tibshirani, 1993). A escolha da mediana como estatística descritiva se deu devido à grande variabilidade observada nas medidas destas variáveis.
Foram aplicados testes comparativos entre dois grupos, de acordo com a resposta positiva ou negativa à fertilização. Posteriormente, foi feita análise de regressão logística univariada. Em uma segunda etapa foi realizada análise de regressão logística múltipla, a fim de identificar quais variáveis estariam, conjuntamente, explicando a probabilidade de fertilização. Para isto utilizou-se o processo de seleção "stepwise". Para discriminar dois grupos quanto a presença ou ausência de fertilização utilizou-se o teste de Wilcoxon para grupos independentes considerando-se as características das amostras estudadas. Com o intuito de descrever o potencial de fertilização de certas variáveis independentes, de interesse neste estudo, foi ajustada a curva ROC (receiveroperating characteristic). A curva ROC foi usada para descrever o desempenho de um teste em um espectro de pontos de corte. Mostra o contrabalanço entre a sensibilidade e a especificidade de um teste e pode, assim, ser usada para auxiliar na decisão de qual é o melhor ponto de corte para a variável independente em questão (Zweig & Campbell, 1993). Baseado neste ponto, estimou-se a razão de verosemelhança como um odds representando quantas vezes é maior a chance de fertilizar sobre não fertilizar, dado que a variável em questão representa uma mensuração maior ou igual ao ponto de corte estimado.
Resultados
Foram avaliados 98 amostras seminais e 678 oócitos. A idade média das mulheres foi de 32,8±3,8 anos e a dos homens, 33,9±5,3 anos. Metade das amostras de sêmen apresentou concentração de espermatozóides por mililitro de sêmen de até 80,0±8,12 unidades e a porcentagem de espermatozóides progressivos rápidos apresentou uma ,mediana de 30,0±3,04.
O teste da maturidade espermática foi realizado em 39 amostras sendo que a porcentagem de espermatozóides imaturos e maduros apresentaram, respectivamente, uma mediana de 15±4,38 e 85±4,79. A TABELA I mostra a análise descritiva de algumas características do sêmen.
Tabela I. Análise descritiva de determinadas características das amostras de sêmen
Em 71 amostras de sêmen foi realizado o teste hiposmótico, obtendo-se uma mediana de 72±1,57 para a porcentagem de espermatozóides com membrana íntegra. Após a capacitação do sêmen, utilizando-se a técnica de Percoll, não foi possível recuperar espermatozóides em duas amostras. As outras 96 apresentaram um valor mediano da concentração de espermatozóides por mililitro de sêmen compatível com 15±3,92 milhões/ml, sendo um valor mínimo de 0,1 e máximo de 105 milhões. A mediana da porcentagem de espermatozóides recuperados do grau A (progressivos rápidos) foi de 100±0.
A TABELA II mostra a mediana do número de óvulos que, após classificados, foram considerados aptos a fecundar e também a quantidade média de espermatozóides com que foi inseminado cada oócito, durante o processo de FIV. A mediana da quantidade de microlitros utilizados por oócito foi de 50,0±25,04 (mínimo de 5 e máximo de 400). Das 98 amostras de sêmen incluídas no estudo, 29 não fertilizaram nenhum oócito (grupo I) e 69 amostras foram capazes de fertilizar pelo menos um oócito (grupo II).
Tabela II. Análise descritiva do número médio de óvulos e inseminados durante a FIV
As TABELAS III e IV mostram a análise descritiva das variáveis estudadas, considerando o grupo que não fertilizou e a ql,lele que fertilizou, respectivamente. A idade média das mulheres que não obtiveram fertilização foi de : 33,5±3,3 anos e a dos homens 34,9±4,4 anos e, nos casais em que pelo menos um oócito foi fertilizado, a idade média das mulheres foi de 32,5±3,9 anos e dos homens 33,4±5,6 anos. A mediana do número de óvulos no grupo I foi de 3,0±0,70 e no grupo II, 8±0,63.
Tabela III. Análise das variáveis estudadas no grupo que não obteve fertilização
Tabela IV. Análise das variáveis estudadas no obteve fertilização
Posteriormente foram feitos testes comparativos para avaliar uma possível diferença entre o grupo que fertilizou (grupo I) e aquele que não fertilizou (grupo II). Somente os grupos foram similares quanto a concentração espermática inicial, % de vivos, % de maduros, % com membrana íntegra e número de espermatozóides inseminados por oócito (TABELA V).
Tabela V. Comparação de algumas variáveis quanto a presença ou ausência de fertilização
Logo foi realizada a análise de regressão logística para verificar quais variáveis tinham influência na probabilidade de fertilizar. Primeiramente, foi feita a análise univariada, e as variáveis que apresentaram um valor de p < 0,1 entraram na análise multivariada. A porcentagem de espermatozóides com motilidade A e o número de óvulos maduros estiveram significativamente associados com a fertilização (TABELA VI).
Tabela VI. Variáveis associadas à fertilização segundo resultado da regressão logística por seleção stepwise.
Posteriormente, através da curva ROC (Figura I), estimou-se a área sob a curva como umacmedida do potencial da porcentagem de espermatozóides progressivos rápidos (% mot_A), em discriminar casos onde se verificou presença ou ausência de fertillização. Obteve-se um valor de 72,2% para esta medida.
Segundo a OMS uma amostra de sêmen considerada normal deve apresentar um valor superior a 30% de espermatozóides do grau A. Com base nesta informação e em dados da curva ROC, estabeleceuse que o ponto de corte para porcentagem de espermatozóides com motilidade do grau A, foi: (30/<30, c ujos valores de sensibilidade e especificidade foram, respectivamente, de 65,2% e 65,5%. Baseado nestes valores, estimou-s.e que o odds de ocorrer a fertilização, dado que a porcentagem de espermatozóides móveis do grau A foi superior a 30% foi de 1,89, ou seja, as chances de fertilizar nesta circunstância é quase o dobro.
Discussão
Neste estudo, avaliou-se a influência de algumas características do sêmen e oócitos sobre a fertilização "in vitro", durante programa de FIV. A análise de regressão logística, mostrou que a característica espermática de maior influência na fertilização do oócito "in vitro" foi a motilidade grau A, sendo que a taxa de fertilização melhorou consideravelmente (81,8% de oócitos fertilizados) quando a motilidade espermática do grau A foi superior a 30%. Um estudo demonstrou que a fertilização falhou quando a motilidade espermática inicial foi inferior a 20%,concluindo que esta e a porcentagem de espermatozóides normais estão associadas ao sucesso da FIV (Mahadevan & Trounsoun, 1984). Também Edwards e colaboradores (1983) consideraram a motilidade espermática inicial inferior a 10% como fator indicador de falha na FIV. Em alguns trabalhos, a motilidade foi discretamente relacionadacoma fertilização "in vivo", encontrando-se algum valor preditivo somente quando as concentrações espermáticas foram inferiores a 5 x 106/ml (Zaini, et al., 1985).
Estudos posteriores evidenciaram que a porcentagem de espermatozóides móveis mostrou-se fracamente relacionada às taxas de fertilização, quando outros parâmetros, como a morfologia, foram incluídos (Liu et al., 1988; Liu & Baker, 1988).
Quando avaliamos o teste de integridade funcional da membrana plasmática, não se observou influência significativa sobre a taxa de fertilização. Jeyendran et al. (1984), consideraram o teste hiposmótico teste simples e útil para avaliar a função espermática. Entretanto, outros estudos não encontraram correlação significativa entre este teste e aquele que serefere à penetração de oócito de hamster (Yanagimachi,et al. 1976),realizados em amostras de sêmen de homens férteis e não-férteis (Ch<in et al., 1985). Outras publicações mostraram que os resultados do teste hiposmótico correlacionaram-se fortemente com a fertilização Hin vitro" e as taxas de gravidez (Check et al., 1989).
Ao analisarmos a maturidade espennática, através do teste de azul de anilina (Terquem & Dadoune, 1983), observamos uma predominância de espennatozóides maduros. Sabe-se que a porcentagem de espermatozóides imaturos é significativamente mais alta em uma população espennática anormal. Entretanto, 20% dos espermatozóides morfologicamente nonnais podem ser parcialmente ou totalmente corados pelo azul de anilina (Dadoune et al., 1988). Sabe-se, ainda, que a amostra de sêmen com motilidade alterada contém maior número de espennatozóides com núcleo imaturo, fortemente corados com azul de anilina (Colleu et al., 1988). Quando comparamos a variável maturidade quanto à presença ou ausência de fertilização, a mesma não se mostrou significativa, talvez devido ao número reduzido de casÇ)s. As 96 amostrastratadas com a técnica de Percoll (Guérin et al, 1989), apresentaram uma mediana para porcentagem de espennatozóides recuperados do grau A de 100±0. Quando estudamos esta variável, através da análise univariada, encontramos um valor significativo de influência na FIV Este dado reforça a importância da qualidade da motilidade espennática sobre o resultado da fertilização Hin vitro". Cabe ainda salientar que as características do movimento celular, pós-migração ascendenteou descendente, estão diretamente relacionadas à qualidade de movimento apresentada pelo espennatozóide, previamente no líquido seminal.
Das amostras estudadas, 29 não fertilizaram nenhum oócito e 69 foram capazes de fertilizar pelo menos um oócito. Embora 60% a 80% dos oócitos fertilizem, 10% a 25% dos casais apresentam baixa <20%) ou nenhuma taxa de fertilização (Liu & Barker, 1994b). Ainda segundo estes autores (Liu & Baker, 1994a;b), defeitos no óvulo não parece ser uma causa comum de baixa fertilização persistente. Na grande maioria dos casos com baixa fertilização (menos de 20% de óvulos maduros fertilizados), as causas são oligozoospermia severa, astenozoospermia, teratozoospermia ou cromossoma anonnal associado a pouco ou nenhum espennatozóide na zona pelúcida (Liu & Baker, 1992b; Franken et al., 1990). Entretanto, nos outros 25% dos pacientes, as causas não são tão óbvias. Um estudo deste grupo mostrou anonnalidades na interação dos gametas. O distúrbio pode ocorrer durante a penetração na zona pelúcida, por um defeito, ou pelo nãodesencadeamento da reação acrossômica e também por uma morfologia alterada ou defeito no DNA da célula espennática (Liu & Baker, 1992a). A penetração do espennatozóide na zona pelúcida está fortemente relacionada com a taxa de sucesso do FIV em pacientes semdefeitos na morfologia espennática e no número de espennatozóides presentes na zona pelúcida. Quando comparamos as variáveis envolvidas no processo de fertilização Hin vitro" quanto à presença ou ausência de fertilização, encontramos uma diferença significativa na concentração inicial dos espennatozóides, na porcentagem de espennatozóides móveis do grau A; na porcentagem de espennatozóides nonnais; no número de óvulos maduros; na concentração de espermatozóides recuperados pós- Percoll e no número de microlitros inseminados por oócito. Considera-se, há vários anos, que a concentração de espennatozóides no ejaculado está relacionada à fertilidade masculina. Embora haja grandes variações deste parâmetro, um grande número de homens inférteis teln concentração espermática inferior < 20x 106/ml) à concentração espennática de homens férteis (Silber, 1989). De acordo com a OMS ( 1992), homens com concentração espennática inferior a 20x 106/ml são considerados subférteis.
Publicações de Mahadevan & Trounson ( 1984) e Acosta et al. ( 1989), demonstraram que a fertilização Hin vitro" tem sido efetiva nos casos de oligoastenospennia não associada a teratospennia ou astenospennia.
A concentração espennática no meio utilizado para a inseminação do oócito foi relacionada com o número de espermatozóides na zona pelúcida e com a taxa de fertilização Hin vitro". Por outro lado, a concentração espennática no sêmen não apresentou valor preditivo para a taxa de fertilização quando outras características espennáticas, tais como a morfologia, foram consideradas (Liu et al., 1988). Também no nosso estudo a concentração espennática no sêmen não mostrou influência na taxa de fertilização Hin vitro" quando a vitalidade foi considerada. Considera-se a morfologia espennática como um dos mais significativos métodos preditores da taxa de fertilização Hin vitro" (Jeulin et al., 1986; Liu et al., 1988; Liu et al., 1989). A morfologia, avaliada pelos critérios da OMS (WHO, 1992), mostrou um valor preditivo limitado nos resultados de FIV (Kruger et al., 1988a; Oehninger et al., 1988; Menkveld, et al., 1990; Enginsu et al., 1991). Observações feitas por Kruger et al.(1986; 1988a), sugeriram que a morfologia espennática, avaliada pelo critério estrito que considera como nonnais os espennatozóides com fonna oval, é o melhor parâmetro para predizer a capacidade fertilizante, Hin vitro", de um espennatozóide.
Amostras de sêmen contendo um valor inferior a 14% de fonnas normais são considerados subférteis e aquelas contendo < 5% são consideradas severamente alteradas (Kruger et al, 1993). Outros laboratórios têm desenvolvido diferentes critérios para a avaliação da morfologia espennática, chegando sempre a conclusões similares (Hinting et al., 1990; Enginsu et al., 1991). Recentes estudos concordaram que a morfologia espennática testada de acordo com o critério estrito (Menkveld et al., 1990), que é um método relativamente simples e barato, proporciona infonnações semelhantes àquelas obtidas através de outros testes mais complexos (Franken et al, 1990; Oehninger et al., 1992) sendo também preditora dos resultados das taxas de gravidez Hin vitro" ou Hin vivo" (Enginsu et al., 1991; Kobayashi et al., 1991; Grow et al., 1994).
Quandoavaliamosa importância da morfologia espermática na probabilidade de fertilizar, também encontramos um valor significativo.
Concordando com os resultados deste estudo, está claro que uma das mais importantes características do espermatozóide humano é sua capacidade de movimento. Ele precisa deste movimento para penetrar no cumulus e na zona pelúcida do oócito. Amostras de sêmen commotilidade inferior a 50%, ou motilidade progressiva inferior a 25%, são tradicionalmente classificados como astenospérmicos e considerados subférteis (WHO, 1992).
A seleção de grupos de critérios diagnósticos para predizer a incidência de gravidez espontânea ou taxas de sucesso de FIV foi feita por Aitken et al., 1991; Liu & Baker, 1992b; Baker, 1994. Estes resultados têm sido úteis, indicando a probabilidade de uma gravidez ocorrer dentro de um tempo específico. Por exemplo, um casal jovem, com uma curta duração de infertilidade e uma oligozoosperrnia moderada, poderá continuar tentando a gravidez natural por mais um ano antes de considerar a necessidade de FIV, já que eles têm chance de 50% de conceber naquele ano. Em contraste, um outro casal, com teratosperrnia severa (> de 95% de anormais) pode ser aconselhado a submeter-se à técnica de injeção intracitoplasmática, devido ao alto risco de falha na fertilização em FIV tradicional e baixa chance de concepção natural, devido à longa duração da infertilidade (Baker, 1994).
O conceito atual é que a fertilidade masculina seja definida baseando-se na concentração de espermatozóides móveis e morfologicamente nonnais. Entretanto, a experiência clínica revela que não é o número absoluto de espennatozóides que prediz a fertilidade, mas, sim, a sua competência funcional. Como resultado, testes "in vitro" continuamsendo desenvolvidospara avaliar a competência funcional destas células e predizer a capacidade fertilizante do espermatozóide humano com razoável acurácia. Em conclusão, a porcentagem de espermatozóides com motilidade A e o número de óvulos maduros tiveram influência significativa na taxa de fertilização "in vitro".
Efron B., Tibshirani R. - An introduction to the bootstrap. New York: Chapman & Hall, 1993.