JBRA Assist. Reprod. 2000;04(01):30-35
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2000.4.1.06
Cultivo in vitro de embriões Mus domesticus domesticus do estádio de 1 -célula a blastocisto eclodido nos meios KSOM e HTF modificados
Mus domesticus domesticus in vitro embryo culture from one cell to ecloded blastocist in KSOM nad HTF medium modified
1Médico Veterinário. Prof. do Curso de Medicina Veterinária da UNOPAR. Arapongas - PR
2Médico. Prof. Adjunto do Departamento de Ginecologia da Faculdade de Medicina da UFRGS
3Médico Veterinário. Pesquisador CNPq.Prof. Titular do Departamento de Patologia Clínica da Faculdade de Veterinária da UFRGS
Resumo
O objetivo dos experimentosfoi determinar a viabilidade da utilização do cultivo " in vitro " de embriões Mus domesticus domesticus em meios KSOM e HTF modificado como controle de qualidade da produção de embriões humanos a partir dafecundação "in vitro ". No experimento 1, embriões 1 - célula ( CFlxSWISS)foram cultivados nos meios KSOM e HTF suplementados com 20% de soro fetal bovino (SFB). Os percentuais de desenvolvimento até o estádio de 2-células foram de 73, 6% em KSOM e 58, 5% em HTF, não sendo observadas clivagens posteriores. O meio KSOM foi eleito para o experimento 2, por apresentar resultado de clivagem estatisticamente superior ao HTF. Neste experimento foi determinada a taxa de clivagem após a adição de SFB ou albumina sérica bovina (BSA) ao meio de cultivo. O meio KSOM com SFB proporcionou uma taxa de clivagem semelhante à observada no experimento onde 79, 6% dos embriões alcançaram o estádio de 2-células. Por outro lado, o meio KSOM com a adição de 4mg/ml de BSA, além de proporcionar taxa de clivagem (83%) semelhante ao obtido com SFB, propiciou um crescimento dos embriões até o estádio de blastocisto eclodido em 13,5%. No experimento 3, na presença de BSA (4mg/ml), a adição de 25 e 20 mM de HEPES aos meios KSOM e HTF, respectivamente, permitiu um desenvolvimento embrionário in vitro dos embriões de 1-célula até blastocistos eclodidos em percentuais de 58, 5 e 56,2 %, respectivamente. Os m e ios HTF e KSOM suplementados com BSA e HEPES são adequados em proporcionar desenvolvimento embrionário até o estádio de blastocisto eclodido na espécie Mus domesticus domesticus. Este sistema pode ser empregado como controle de qualidade do meio HTF utilizado em procedimentos defecundação "in vitro" na espécie humana.
Unitermos: blastocisto, meio HTF, meio KSOM, cultura embriões, controle de qualidade de meio.
Abstract
The experiments were design to determine the viabiliy of a mice embryo in vitro culture system, using RTF and KSOM media, as a quality control of an human in vitro fertilization programo Experiment 1: embryos 1- cell ( CF 1 xSWISS) were cultivated in KSOM and RTF suplemented with 20% of bovine fetal serum. Experiment 2: observation of the clivage after adition of bovine serum albumin to the culture medium. Experiment 3: determination ofthe clivage and hatched blastocyst rate in the presence of the bovine serum albumin and REPES in the culture media. The percentage of development to 2-cells embryo was 73,6% with KSOM and 58,5% with RTF in the first experiment. The KSOM suplemented with bovine serum albumin result in similar percentage of clivage compare with the first experiment. In the third experiment the percentage of development to 2 cells embryo was 84,9% with KSOM and 84,2% with RTF. The percentage of development to the hatched blastocyst stage was 58,5% with KSOM and 56,2% with RTF. The RTF and KSOM media suplemented with BSA and REPES are able to support Mus domesticus domesticus embryo development to the hatched blastocyst stage.This system may be utilized as a quality control of RTF medium utilized in human in vitro fertilization procedures
Key words: embryo culture, RTF media, KSOM media, blastocyst development, medium quality control
Introdução
O desenvolvimento "in vitro" de embriões murinos de 1 -célula até b lastocisto foi reportado pela primeira vez por Whitten & Biggers (1968), utilizando doadoras do cruzamento C57BL/10J x SJL/J. Com exceção de algumas linhagens isogênicas e cruzamentos FI (Goddard & Pratt, 1983), embriões de 1 -célula cultivados "in vitro" apresentam o chamado bloqueio das 2-células, ou seja, realizam apenas a primeira clivagem e não se desenvolvem até estádios mais avançados. Muggleton- Rarris et al. (1982) e Goddard & Pratt (1983) demonstraram que este fenômeno é mediado por componentes citoplasmáticos de origem materna. Desta forma, a ausência destes componentes dificulta o desenvolvimento "in vitro" até o estádio de blastocisto. Além da causa genética, a habilidade dos embriões 1- célula de se desenvolverem " in vitro" sofre ação de vários outros fatores, como por exemplo a composição dos meios (Ro et al., 1995; Dawson & Baltz, 1997; Devreker & Rardy, 1997 ; Leppens-Luisier & Sakkas, 1997) e as condições de cultivo (Bavister, 1988; Gardner & Leese, 1990; O'Neill, 1997). Assim sendo, o procedimento básico para o estudo dos efeitos da variação de cada componente, um a um, é ineficiente, não sendo capaz de detectar possíveis interações entre os diferentes componentes e entre diferentes fatores.
Assim como o camun dongo, outras es pec les mamífe ras também apresentam o bloqueio de crescimento "in vitro" em alguma fase do período de desenvolvimento pré-implantação. Entre elas pode-se citar o "golden hamster" , com bloqueio entre 2 e 4-células (Shini & Bavister, 1988; Bavister & Minami, 1986); o suíno na fase de 4-células (Davis & Day, 1978); o coelho na fase de mórula (Bavister, 1987); o ovino (Tervit et al., 1972; Tervit & Rowson, 1974), o bovino (Camous et al., 1984 ; Heyman et al., 1987; Heyman & Menezo, 1987) e o macaco Rhesus (Bavister, 1987) entre 8 e 16- células.
O objetivo dos experimentos foi verificar a viabilidade de um sistema de cultivo "in vitro" de embriões Mus domesticus domesticus, empregando os meios KSOM e HTF como controle de qualidade da produção de embriões humanos a partir da fecundação " in vitro".
Material e Métodos
Animais
Os embriões foram produzidos a partir do cruzamento de fêmeas da linhagem CFI de 6 a 8 semanas de idade, com machos da linhagem SWISS, fornecidos pela Fundação Estadual de Pesquisa em Saúde da Secretaria de Saúde e Meio Ambiente do Estado do Rio Grande do Sul, em Porto Alegre. Os animais foram mantidos em biotério climatizado com iluminação controlada (14h luz/dia), ventilação constante, temperatura entre 18 e 22°C, água e ração "ad libitum".
Meios
Para colheita dos embriões 1 -célula foi utilizada a solução salina fosfato tamponada (PBS) de Dulbecco & Vogt (1954), modificada por Whittingham (1971). Os embriões foram cultivados no meios KSOM e HTF suplementados com 20% de SFB (Nutricell) ou 4mg/ ml de BSA (Gibco/BRL) acrescidos ou não de HEPES (Tabela I).
Tabela I. Composição (mM) dos meios de cultivo.
Os sais foram pesados em balança analítica (Kem 410) e após diluídos em água ultra-pura (Milli-Q). A osmolaridade apresentava valores entre 270 e 290 mOsm/kg (Precision Systems), sendo o pH (Celm) ajustado para valores entre 7, 10 e 7,20 (Brinster, 1965). Os meios foram filtrados pela passagem através de membranas com poros de 0,22µm (Millipore). As partidas dos meios de cultivo foram mantidas à 4°C por, no máximo, duas semanas.
Superovulação
As fêmeas da linhagem CFI foram superovuladas por injeção intra-peritoneal de I OUI de gonadotrofina coriônica equina - eCG (Folligon-Intervet), seguida 46 horas após, de 10UI de gonadotrofina coriônica humana - hCG (pregnyl-Organon). Imediatamente após a segunda injeção, as fêmeas foram colocadas com os machos (de fertilidade comprovada) da linhagem SWISS, na proporção de 2 fêmeas por macho. A cópula foi confinnada pela presença do tampão vaginal 17 a 19h após a injeção do hCG.
Colheita dos embriões
Para a colheita dos embriões, as camundongas foram sacrificadas por deslocamento cervical 30 horas após a aplicação do hCG. Os ovidutos foram retirados e mantidos em solução de PBS suplementado com 20% de SFB (PBSm). Os ovidutos eram escarificados, com o auxílio de uma seringa de 1 ml com agulha 30G (B&D) com bisel, no local dilatado que continha o novelo de oócitos agregados pelas células do "cumulus oophorus". As células de "cumulus oophorus" foram removidas pela exposição a 300UI/ml de hialuronidase (Sigma) por 20 segundos. Após a exposição, os embriões foram lavados 5 vezes em PBSm e mais 3 vezes em meio KSOM ou HTF antes de serem colocados em cultivo.
Condições de cultivo
Os embriões foram cultivados em grupos de 20 em gotas de 50µl de meio sob óleo mineral (Sigma) em placas de Petri de 35mm de diâmetro (Costar) por 120 horas. Após o preparo das gotas de meio sob óleo mineral, as placaseram colocadas na estufa (Forma Scientifica) a 37°C, 5% CO2 em ar e 100% de umidade relativa do ar por um período mínimo de 2 horas para equilíbrio do sistema de cultivo. O desenvolvimento dos embriões mantidos em cultivo era avaliado a cada 24 horas.
Análise estatística
As estruturas viáveis de cada doadora foram distribuídas aleatoriamente entre os tratamentos. Cada experimento representa um mínimo de 2 replicações realizadas pelo mesmo executor. Foi utilizado o Teste do qui-quadrado (x2) com nível de significância de 95% (p<0,05).
Resultados
Experimento 1
Um total de 599 embriões 1 -célula (CFl xSWISS) foi cultivado por 120h nos meios KSOM e HTF suplementados com 20% de SFB (Tabela II). As taxas de clivagem até 2 células foram de 58,5% para o HTF e 73,6% parao KSOM. Os resultados obtidos mostraram que apesar dos embriões apresentarem 100% de bloqueio no estádio de 2-células, o meío KSOM foi significativamente superior ao meio HTF em propiciar a ocorrência de clivagem.
TABELA II. Desenvolvimento in vitro de embriões 1- célula Mus domesticus domesticus nos meios KSOM e HTF com 20% SFB.
TABELA III. Desenvolvimento de embriões 1 -célula Mus domesticus domesticus em meio KSOM suplementado com 20% de SFB ou 4mg/ml de BSA.
Experimento 2
A suplementação do meio KSOM com 20% de SFB ou 4mg/ml de BSA no cultivo por l 20h p roporcionou taxas de clivagem (2-células) semelhantes, porém somente o grupo suplementado com BSA apresentou crescimento embrionário até o estádio de blastocisto eclodido.
Experimento 3
A adição de 25 e 20mM de HEPES aos meios KSOM e HTF, respectivamente, proporcionou percentuais de crescimento embrionário de 84,9% (KSOM) e 84,2% (HTF) até embriões de 2-células e de 58,5% (KSOM) e 56,2% (HTF) até blastocistos eclodidos (Tab. IV).
TABELA IV. Desenvolvimento in vitro de embriões 1 -célula Mus domesticus domesticus nos meios KSOM e HTF suplementados com 4mg/ml de BSA e 25 e 20mM de HEPES.
Discussão
No primeiro experimento constatou-se o bloqueio de 100% dos embriões colocados em cultivo no estádio de 2-células nos meios KSOM e HTF suplementados com SFB. A baixa taxa de clivagem no meio HTF, provavelmente resultou da presença de altas concentrações de lactato (21 ,4mM) e de EDTA (0.11 mM), conforme já observaram Chatot et al. ( 1989). Por outro lacto, o meio KSOM, que apresentou uma taxa de clivagem superior, além de possuir menores níveis de lactato e de EDTA (10,0 e 0,01 mM) possui também uma relação piruvato/lactato inferior (50:1) quando comparada ao meio HTF (65:1).
Para Schini & Bavister (1988); Lawitts & Biggers (1991) e Seshagiri & Bavister (1991) o bloqueio das 2- células também pode ser devido à presença da glicose no meio nas primeiras 48h de cultivo. Chatot et al. (1989), estudando o efeito da glicose sobre o bloqueio de 2-células, observaram que após 48h de cultivo sem glicose, a exposição dos embriões em meio com glicose promove um maior desenvolvimento até o estádio de blastocisto. Desta forma, concluíram que além da ação de componentes citoplasmáticos de origem materna (Muggleton-Harris et al., 1982; Goddard & Pratt, 1983 e Pratt & Muggleton-Harris, 1988), a metabolização de parte da glicose por células do "cumulus oophorus" (Gardner & Leese, 1990) também contribui para evitar que ocorra o bloqueio no desenvolvimento "in vitro". No experimento 2, a substituição no meio KSOM do SFB por BSA proporcionou o crescimento embrionário além do estádio de 2-células, alcançando taxas de 41.1 % de blastocisto e de 13.5% de blastocisto eclodido. Estes resultados não foram ainda satisfatórios, pois são inferiores aos relatados por Erbach et al. (1994) e Summers et al. (1995) que obtiveram 88, 1 e 90,0% de blastocisto, respectivamente, cultivando in vitro embriões murinos a partir de 1 -célula em meio KSOM. Na opinião de Caro & Trounson (1984), o cultivo "in vitro" de embriões murinos com meios suplementados com SFB, BSA ou na ausência de proteína não deve apresentar diferença nos percentuais de desenvolvimento. Contrariando estas observações, FitzGerald & Di Mattina (1992) relataram que a adição de soro aos meios CZB e Earle para o cultivo de embriões humanos provocou diminuição na taxa de sobrevivência embrionária em relação aos cultivados na presença de BSA.
De acordo com opinião de Maurer (1992), o soro pode fornecer tanto elementos benéficos ao meio de cultivo, como por exemplo, substratos energéticos, aminoácidos, vitaminas e fatores de crescimento, como produzir componentes tóxicos, devido à alterações forma de evitar os efeitos deletérios de contaminantes, Bavister (1995) recomenda o uso de BSA fração Y com 96 a 99% de pureza. De acordo com o autor, a vantagem da utilização desta proteína com alto grau de pureza é a propriedade de poder ser consumida pelos embriões via endocitose, fornecendo desta maneira aminoácidos para os proce ssos metabólicos e anabólicos.
A presença de HEPES, no experimento 3 (Tabela 4), provavelmente alterou as propriedades físicas do meio, principalmente a capacidade tamponante, proporcionando condições mais adequadas para o desenvolvimento embrionário "in vitro". De acordo com Montagner et al. (1998), a adição de HEPES aos meio de cultivo resulta em um pH mais estável entre 7, I e 7,2 com osmolaridade entre 270 e 290mOsm/Kg.
Conclusão
O sistema de cultivo in vitro de embriões Mus domesticus domesticus a partir do estádio de 1 -célula em meio KSOM e HTF modificado pode ser empregado como controle de qualidade das condições do cultivo em procedimentos de fecundação "in vitro" na espécie humana.
Bavister B. D. - The mammalian preimplantation embryo. Plenum Press. New York,. 379 p, 1987