JBRA Assist. Reprod. 2000;04(01):40-44
ATUALIZAÇÃO
doi: 10.5935/1518-0557.2000.4.1.08
Resumo
Apesar de durante a ICSI o espermatozóide ser injetado diretamente no interior de um oócito maduro, nem sempre a fertilização ocorre. Esta não fertilização pode estar relacionada a diversos fatores, sendo os fatores espermáticos os mais importantes, tais como presença de radicais livres no sêmen, anormalidades cromossômicas e defeitos protéicos na superfície dos gametas ou na organização de sua cromatina. A identificação destes fatores pode contribuir para a melhoria dos resultados após a ICSI.
Unitermos: DNA espermático, ICSI, cromomocina A3, protamina, espécies reativas ao oxigênio.
Abstract
Even in the course of ICSI process the spermatozoa is injected into a mature oocyte, not always the fertilization occurs. The failure fertilization can be associated with several factors been the spermatic factors the most important, such as free radicais in semen, chromosoal aberrations and proteic deffects on gamete surface or in its cromatine packaging. The identification of these factors can contribute for better results after ICSI.
Key words: human spermatozoa, chromatin packing, ICSI, chromomycin A3 protamine, reactive oxygen specles.
Introdução
As técnicas de reprodução assistida (TRA) empregadas atualmente para o tratamento da infertilidade vêm apresentando grande desenvolvimento tecnológico. Um marco importante no avanço das TRA ocorreu 1992, quando Palermo et al. descreveram a técnica de injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI), a qual revolucionou o tratamento da infertilidade por fator masculino grave. Já em 1993, Van Steirteghem et al., reportaram taxas de gestação de aproximadamente 35%, bastante superiores àquelas obtidas de outras técnicas de micromanipulação de gametas (PZD- partial zone dissection; Suzi - subzonal insertion). Assim sendo, a ICSI é hoje a TRA mais empregada nos casos onde existem graves alterações nos parâmetros seminais, superando os resultados obtidos com qualquer outro tipo de técnica.
Com o advento da ICSI, postulou-se que a infertilidade masculina estaria com seus dias contados, pois com a utilização dessa técnica não haveria mais obstáculos para a interação dos gametas (Payne et al., 1994). O único critério necessário para realização da ICSI é a presença de, no mínimo, um espermatozóide vivo na amostra seminal, haja visto que a concentração, motilidade e morfologia espermáticas não apresentam influência significativa sobre as taxas de fertilização (Nagy et al., 1995). Entretanto, o que se observa na prática é que as taxas de fertilização pós ICSI podem variar de 30% a 80 %, ou seja, mesmo injetando-se um espermatozóide no interior de um óocito maduro, pode haver uma taxa de insucesso significativa. Dubey et al. (1997), estudando oócitos que apresentam falha de fertilização após a ICSI, demonstraram que a falha técnica na deposição do espermatozóide no interior do oócito não é a maior causa de falha de fertilização em ciclos de ICSI. Assim sendo, a não ocorrência de fertilização com a utilização da ICSI pode estar relacionada a outros fatores, tais como a presença de radicais livres no sêmen, anormalidades cromossômicas e defeitos protéicos na superfície dos gametas ou na organização de sua cromatina. O papel desses fatores intrínsicos, de origem espermática e oocitária, devem ser melhor estudados, pois podem estar relacionados a um mau prognóstico após a ICSI, uma vez que impossibilitam a conclusão da meiose, a descondensação de DNA e a formação dos pronúcleos (Sakkas et al., 1996; Dubey et al., 1997). Embora a fisiologia deste mau resultado pós ICSI ainda não seja compreendida, há evidências de que alterações bioquímicas ou até mesmo moleculares inerentes ao espermatozóide s ej am mais importantes que a morfologia espermática (Sakkas et al., 1996). Além disso, a deficiência de alguns fatores contidos no citoplasma do oócito, responsavéis pela descondensação da cromatina espermática, também contribui para a falha de fertilização pós-ICSI (Dubey et al., 1997). A deficiência desses fatores responsáveis. pela descondensação da cromatina ocorre quando não há maturação citoplasmática completa do oócito, mesmo quando este se encontra em metáfase II quando injetado (Dubey et al., 1997). Diante dessas observações, estudos devem ser realizados com o intuito de se desenvolverem técnicas que possibilitem a investigação das anormalidades moleculares (DNA). A seguir, abordaremos algumas causas de máfertilização após a ICSI relacionadas ao espermatozóide.
Anomalias na compactação da cromatina espermática
A compactação do DNA espermático ocorre durante a espermatogênese e depende fundamentalmente da presença de protamina (Bianchi et al., 1996 b). Esta alta compactação da cromatina nuclear espermática ocorre fundamentalmente através da troca de histonas pela protamina, o que torna o DNA espermático altamente resistente às desnaturações físicas e químicas (Lopes et al., 1998). Em homens subférteis, defeitos na compactação da cromatina causam instabilidade do DNA e maior susceptibil idade à desnaturação (Manicardi et al., 1995). Após a fertilização do óocito, ocorre então a desc ondensação da cromatina espermática, processo indispensável para que ocorra a interação entre os gametas. (Sakkas et al., 1996).
A defeituosa deposição de protamina durante a espermatogênese parece ser um dos principais fatores relacionados aos problemas na compactação do DNA. Vários estudos têm demonstrado que espermatozóides de pacientes in férteis exibem anomalias em sua cromatina relacionadas à disposição irregular de protamina durante a espermatogênese. As regiões do DNA que apresentam deficiência de protamina têm grande probabilidade de exibirem alterações importantes, tais como desnaturação e fragmentação (Bianchi et al., 1993). Como a qualidade de espermatogênese está diretamente subordinada a fatores genéticos e às condições do trato reprodutivo, anormalidades relacionadas a esses fatores podem ter como consequência irregularidades no depósito de protamina e falhas no processo de compactação e proteção de cromatina espermática. Portanto, defeitos relacionados à protamina estão atribuídos a fatores e anomalias no trato reprodutivo masculino, sendo causas importantes de anormalidades no processo de compactação do DNA (Sakkas et al., 1996).
Experimentalmente, tem sido utilizado um método que tem como objetivo verificar a qualidade da compactação A3(CMA3) essa substância é um fluorocromo guaninacitosina específico que evidencia a baixa qualidade de compactação da cromatina em espermatozóides humanos. Assim sendo, a CMA3 permite uma visualização indireta da deficiência de protamina e da quebra ou desnaturação parcial do DNA (Bianchi et al., 1993 e 1996 a,b; Manicardi et al., 1995 ; Sakkas et al., 1996).
Experiências utilizando CMA3 mostraram que semêns com alta fluorescência (taxas de CMA3->40%) estão relacionados a alterações na morfologia espermática e baixas taxas de fertilização utilizando-se SUZI (Bianchi et al., 1996 a). Esterhuizen et al., (2000) observaram que sêmens com <4 % de formas normais pela morfologia estrita apresentaram taxas signi ficativamente mais elevadas de CMA 3 em comparação as amostras com <4% de formas normais. Além disso, estes autores reportaram uma relação inversa significativa entre os níveis de CM3 e as taxas de fertilização após FIY. Por outro lado, Sakkas et al. (1996) não observaram diferença s ignificativa entre as taxas de fertilização de pacientes com altas ou baixas taxas de CMA3-positivo utilizando-se a ICSI. Gravidezes foram obtidas utilizando espermatozóides de pacientes com alta fluorescência CMA3 e grande quantidade de fragmentação de DNA Entretanto, ao analisarem os espermatozóides injetados em óocitos que não fertilizaram, observaram maior incidência de espermatozóides que permaneceram com suas cromatinas condensadas entre os pacientes com altas taxas de CMA3 - positivo. Uma conclusão sobre este achado seria que a baixa qualidade da compactação da cromatina espermática prejudicaria o processo de descondensação do DNA espermático após a fertilização e a interação entre os gametas, podendo representar uma possível causa de ausência de fertilização após ICSI. De fato, um estudo realizado por Lopes et al., 1998 demonstrou que defeitos do DNA espermático podem contribuir para a falha de fertilização após a ICSI.
Portanto, a utilização da CMAj pode ser útil para nos in formar sobre a qualidade da compactação da cromatina, permitindo a visualização indi reta da deficiência de protamina e evidenciando a presença de quebras endógenas do DNA espermático (Bianchi at al., 1996 a,b; Sakkas et al., 1996). A detecçao de alterações da cromatina espermática poderia ser incluída como um método na avaliação do fator mascul ino, pois apresenta grande valor. Prognóstico em relação aos resultados das técnicas de fertilização assistida.
Espécies reativas de oxigênio
As espécies reativas ao oxigênio (ERO) vêm sendo estudadas desde a década de 80, sendo apontadas como importante causa de infertilidade. As ERO incluem os radicais livres, os quais são agentes potencialmente oxidativos. As principais ERO presentes no sêmen são o peróxido de hidrogênio (HP2) o o ânion superóxido (O2) e o radical hidroxila (OH) (Woff, 1995), dentre os quais o peróxido de hidrogênio apresenta ação mais deletéria sobre os espermatozóides humanos (de Lamirande & Gagnon, 1992). A maior concentração de ERO observada em sêmens de pacientes inférteis (D'Agata et al., 1990; Aitken et al., 1991; Iwasaki & Gagnon, 1992Mazzilli et al., 1994) e em sêmens com concentração, motilidade e morfologia alteradas (Agarwal et al., 1994; Sukcharoen et al.,1995, 1996; Zalata et al 1995) demonstram a ação deletéria dos radicais livres de oxigênio sobre o espermatozóide e sobre as diversas etapas da fertilização.
A fonte primária das ERO no plasma seminal são os próprios espermatozóides e os leucócitos polimorfonucleares. As ERO são fisiologicamente produzidas pelo espermatozóides e são necessárias, por exemplo, para a ocorrência dos processos de capacitação espermática e reação acrossômica (de Lamirande et al., 1993). Entretanto, existem fortes indícios de que os radicais livres estej am envolvidos na etilologia dos defeitos da função espermática, pois altas concentrações de ERO promovem a peroxidação dos ácidos graxos insaturados da membrana plasmática do espermatozóides, a qual se torna mais rígida (Jones et al., 1979). Este aumento da rigidez da membrana plasmática do espermatozóide afeta diretamente os resultados da FIV, pois prejudica o processo de fusão do espermatozóide com o oócito (Jones et al., 1979; Aitken, 1989; Aikten et al., 1989) e também a clivagem embrionária (Nasr-Esfahami et al., 1990, 1992). O espermatozóide humano é particularmente susceptível ao dano peroxidativo, pois suas membranas contêm altas concentrações de ácidos graxos insaturados (Jones et al., 1979). Esta riqueza em ácidos graxos insaturados con fere maior fluidez às membranas dos espermatozóides, fator indispensável para o processo de fusão com a membrana oocitária durante a fertilização (Aitken & Fisher, 1994).
Um outro fator que contribui para o aumento na geração de ERO é a remoção do plasma seminal e o processo de centrifugação e ressuspensão utilizados no preparo do sêmen para as TRA (Iwasaki & Gagnon, 1992; Agarwal et al., 1994). Este processo promove um contato direto dos espermatozóides com os leucócitos, sabidamente produtores de ERO (Aikten & Clarkson, 1988). Já a remoção do plasma seminal torna os espermatozóides mais suceptíveis ao dano oxidativo, pois a maioria das substâncias estão presentes no plasma seminal (Jones et al., 1979; Iwasaki & Gagnon, 1992).
Homens com alta proteção pelo plasma seminal podem apresentar danos severos em seus espermatozóides devido à deficiência de substâncias antioxidantes (Kovalski et al., 1992). As variações que ocorrem na tensão de oxigênio durante a manipulação dos gametas representam um outro fator que pode promover aumento na geração de ERO, prejudicando o desenvolvimento embrionário (Pabon et al., 1989).
Os altos níveis de ERO observados em sêmens alterados parecem ser decorrentes de defeitos na espermatogênese, havendo retenção de um excesso de citoplasma residual e aumento da disponibilidade de algumas enzimas citoplasmáticas que favorecem a geração de ERO (Aitken & Fisher, 1994), o que explicaria o baixo potencial de fertilização de espermatozóides anormais.
Portanto, a produção excessiva de ERO pelos espermatozóides contribui para as taxas de sucesso obtidas pela FIV convencional na presença de fator masculino.
Por outro lado, hoje se sabe da interferência das ERO sobre a estrutura do DNA espermático, fragmentandoo, sendo portanto causa indireta de má-fertilização através interferência no processo de compactação do DNA. Lopes et al. 1998, demonstraram que altas concentrações de ERO no sêmen podem levar a problemas a nível molecular, como por exemplo distúrbios na descondensação da cromatina espermática e fragmentação do DNA. Assim sendo, altos níveis de radicais livres podem influir nos resultados da ICSI e a utilização de substâncias antioxidantes durante o preparo do sêmen para ICSI podem reduzir significadamente o dano ao espermatozóide e contribuir para melhores resultados (Lopes et al., 1998).
Aberrações Cromossômicas
A incidência de aberrações cromossômicas entre casais inférteis, tanto no homen quanto na mulher, é bastante elevada se comparada à incidência na população geral (Hens et al., 1988). Esta incidência também é bastante alta entre os homens com graves alterações nos parâmetros seminais (Pandiyan & Jequier, 1996). Com o advento da ICSI, deu-se oportunidade a estes homens de terem filhos, os quais podem herdar as aberrações cromossômicas dos pais e, consequentemente, serem também infertéis (Testart et al., 1996). Entretanto, pouco ainda se sabe a respeito da influência destas alterações sobre o prognóstico de sucesso da ICSI. Um estudo realizado por Scholtes et al. (1998), demonstrou que as taxas de implantação e gravidez são menores entre casais cuj o homem apresenta alterações dos cromossomas sexuais (mosaicismos). Portanto, este problema representa um outro fator prejudicial aos resultados da ICSI e deve ser mais frequentemente pesquisado.
Conclusão
Embora tenha havido um grande desenvolvimento das técnicas de reproducão assistida nos últimos anos, os resultados de fertilização ainda não são totalmente satisfatórios. Danos moleculares, como por exemplo as anomalias na compactação da cromatina espermática e fragmentação do DNA, tem sido atualmente responsabilizados pelo insucesso da fertilização pós ICSI. Por isso, toma-se importante o desenvolvimento de técnicas capazes de identificar essas alterações para avaliação da qualidade dos gametas antes da realização das TRA, reduzindo-se assim as taxas de insucesso. O conhecimento das bases moleculares e genéticas do fator masculino é importante para compreensão das causas inerentes ao espermatozóide que há alguns anos não eram conhecidas. O dano oxidativo causado pelas ERO também deve ser evitado, sej a através da diminuição na geração das ERO ou através da adição de substâncias antioxidantes.