JBRA Assist. Reprod. 2000;04(02):51-59
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2000.4.2.02
Estudio preconcepcional en un heterocigota de translocacion t(1;4) (p32;q25). Analisis de segregacion y aneuploidia por FISH doble y triple color
Resumen
Introducción: Los reordenamientos cromosómicos equilibrados se asocian con infertilidad debido a que los portadores producen gametas con desequilibrios cromosómicos, que conducen a concepciones anormales, las cuales pueden ser letales o dar lugar a nacidos mal formados. Evaluar la segregación del cuadrivalente meiotico y el posible efecto intercromosómico del mjsmo. Se escogió la pareja para ingresar a nuestro programa de Diagnóstico Genético Preimplantatorio (DGP ) esta pareja presenta antecedentes de cuatro abortos espontáneos, dos de ellos con estudio cromosómico anormal. La mujer con cariotipo normal y el varón 46, XY, t(1; 4)(p32;q25). Antes de acceder al DGP decidimos estudiar a los espermatozoides para analizar la segregación del cuadrivalente con sondas, que a posteriori, serían usadas en el DGP, y además evaluar el efecto intercromosómico sobre los cromosomas 13, 18, 21 y los sexuales.
Los estudios se realizaron sobre extendidos de espermatozoides previamente decondensados. Se usaron para realizar el FISH las siguientes mezclas de sondas: a) dos centroméricas de los cromosornas 1 y 4, Y una telomérica 4q; b) Tres centroméricas de los cromosomas 18, X e Y; c) Dos loci específicas de los cromosomas 13 y 21.Se analizaron aproximadamente 1000 espermatozoides para cada mezcla de sondas utilizadas, registrándose los patrones de segregación del cuadrivalente meiótico con las sondas centroméricas I y 4 Y la telomérica 4q, y las nulisomías, disomías y diploidias con las sondas de los cromosomas 13, 18, 21 Y cromosomas sexuales. Las frecuencias de los patrones de segregación alternada, adyacente I, adyacente II y 3: I fueron: 24.0%, 26.4%, 11.4% Y 38.2%, respectivamente. Las frecuencias de aneuploidías de los cromosomas 13, 18, 21 y par sexual fueron: 21.5%, 15.2%, 31.0% Y 28.2%, respectivamente. Además se encontró una frecuencia de espermatozoides presumiblemente diploides de 11.2%. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el futuro DGP, no sólo se deberían estudiar los cromosomas involucrados en la translocación, sino también a los correspondientes a las aneuploidías viables más frecuentes, debido ai efecto intercromosómico demostrado.
Palabra clave: espermatozóides, FSH, aneuploidia
Resumo
Os reordenamentos cromossômicos equilibrados se associam com infertilidade devido aos portadores de gametas com desequilíbrios cromossômicos, levando a concepções anormais, as quais podem ser letais, dando lugar a nascidos com mal formação. O objetivo era validar a segregação do quadrivalente meiótico e o possível efeito intercrortlossômico do mesmo. Foi consultado para ingressar em nosso programa de Diagnóstico Genético Pré Implantação (DGP) casais com antecedentes de quatro abortos espontâneos, sendo dois deles com estudo cromossômÍco anormal. A mulher com cariótipo normal e o marido com 46, XY, t (1; 4) (p32;q25). Antes de realizar o DGP, decidimos estudar os espermatozóides para analisar a segregação de quadrivalente com sondas que posteriormente seriam usadas em DGP, além disso validar o efeito intercromossômico sobre os cromossômos 13, 18 , 21 e os sexuais. O estudo foi realizado sobre esfregaço de espermatozóides previamente descondensados. Foi utilizado para realizar ASH as seguintes misturas de sondas: a) duas centroméricas dos cromossômas 1 e 4 e uma telomérica 4q; b) três centroméricas dos cromossomas 18, Xe Y; c) dois loci específicas dos cromossômas 13 e 21. Foram analisadas aproximadamente 1000 espermatozóides para cada mistura de sonda utilizada registrando-se os padrões de segregação do quadrivalente meiótico com as sondas centroméricas 1 e 4 e a telomérica 4q e as nulissomias, dissomias e diploidias com as sondas dos cromossômos 13, 18, 21 e cromossômos sexuais. Foi encontrado nos resultados que as frequência dos padrões da segregação alternada, adjacente I e adjacente II e 3: I foram: 24%; 26.4%; 11.4% e 38.2% respectivamente. As frequências das aneuploidias dos cromossômas 13, 18 e 21 e para sexuais foram 21.5%; 15.2%; 31.0 % e 28.2 %, respectivamente. Além disso foi encontrado uma frequência do espermatozóide presumidamente diplóide de 11.2%. Em conclusão, tendo em vista os resultados encontrados, sugere-se que no futuro DGP deva ser estudado os correspondentes à aneuploidias viáveis mais frequentes, devido ao efeito intercromossômico demonstrado, além das translocações.
Introducción
Entre los factores que contribuyen con la infertilidad masculina, las anomalías cromosómicas son un hallazgo frecuente. Aproximadamente un 10% tienen alteraciones de tipo constitucional, existiendo una clara relación entre la severidad del espermograma y la proporción y tipos de anomalías cromosómicas. EI porcentaje de alteraciones de cromosornas sexuales es mayor entre los azoospérmicos y oligozoospérmicos severos, mientras que en los oligozoospérmicos los rearreglos estructurales equilibrados son más frecuentes. (Coco et al., 1986; Coco 1995).
Los portadores de reordenamientos equilibrados, la mayoría de las veces se detectan en vida adulta por causar esterilidad y/ o infertilidad, debido a que el reordenamiento equilibrado interfiere con el proceso meiótico, bloqueándolo o produciendo gametas con desequilibrios cromosómicos, dependiendo de la segregación del multivalente (adyacente I, adyacente II, segregación 3: 1 y 4:0) los cuales conducen a concepciones anormales, que pueden ser letales o dar lugar a nacidos malformados con cromosomopatías. Además el multivalente puede afectar la normal separación de otros cromosomas; fenómeno conocido como efecto intercromosómico. De hecho hay estudios cromosómicos realizados en padres de ninos con aneuploidías que demuestran la mayor frecuencia de reordenamientos equilibrados. (Gallego & Coco, 1988).
Por otro lado la pérdida fetal frecuentemente es resultado de anomalías cromosómicas numéricas. Hassold et al, 1978 estimaron que aproximadamente el 50% de los abortos espontáneos del primer trimestre son cromosomicamente anormales, siendo aproximadamente 96% anomalias numéricas y el resto anomalías estructurales. La inayoría de las anomalías numéricas se originan de novo debido a no disyunción meiótica en un progenitor o a unã no disyunción mitótica post fecundación. Koehler et al, 1996 con estudios moleculares para determinar el origen de las aneuploidías, sugieren que la no disyunción materna es la principal causa de las trisomías autosómicas, mientras que la paterna lo es para las aneuploidías de los cromosomas sexuales. En cambio las anomalias estructurales la mayoría de las veces son trasmitidas· por progenitores portadores de rearreglos estructurales. Por otro lado, los estudios cromosómicos realizados en parejas con aborto a repetición señalan una mayor incidencia de rearreglos equilibrados respecto de la población general (Coco et al, 1987). La finalidad de los estudios genéticos en infertilidad es descartar o aseverar la causa genética de la misina. La coltoboración de dicha causa adquiere importancia, no sólo desde el punto de vista académico sino fundamentalmente en cuanto a pronóstico y asesoramiento. Hasta hace relativamente poco tiempo para el asesoramiento genético de portadores de rearreglos equilibrados se disponía del riesgo teórico, y si lo hubiera del empírico, informándose el estudio prenatal con fines preventivos. En la actualidad con el advenimiento de los estudios citogenéticos moleculares en gametas, es factible estimar el porcentaje de anomalias en las mismas. El propósito es comunicar los resultados de los estudios realizados en una pareja infértil que consultó para ingresar al programa de diagnóstico genético preimplantatorio (DGP). Se trata de una pareja joven, sana y no consanguínea con el antecedente de cuatro abortos espontáneos, dos de ellos con estudios cromosómicos anormales. La mujer terna un cariotipo normal, mientras que el varón presentaba una translocación entre el brazo corto del cromosoma 1 y el brazo largo del cromosoma 4 (Fig. 1 y 2). Antes de acceder ai DGP decidimos realizar estudios preconcepcionales co nla finalidad de estimar el riesgo con que cuenta la pareja para el establecimiento de una embarazo mal constituido y determinar los estudios citogenéticos moleculares necesarios para que el diagnóstico preimplantatorio tenga la mayor eficiencia diagnóstica.
Fig. 1. Cariotipo parcial con bandeo G: las flechas muestran los cromosomas 1 y 4 translocados
Fig. 2. Metafase hibridada con sondas totales de los cromosomas 1 y 4. Las flechas muestran los cromosomas l y 4 translocados.
Materiales y Métodos
Se efectuaron estudios cromosómicos de sangre periférica de la pareja, en fibroblastos de los dos últimos abortos, y en espermatozoides del portador. Los cultivos de sangre y fibroblastos se realizaron de acuerdo a técnicas citogenéticas estándar, las que se cornplementaron con estudios de FISH con sondas totales de los cromosomas 1 y 4.
Cariotipo de la mujer: 46, XX
Cariotipo del varón: 46, XY, t(1; 4)(p32;q25)
Cariotipo del tercer aborto espontáneo: 46, XY, der(1)pat(1 qter_centp32::4q25_4qter)
Cariotipo del cuarto aborto espontáneo: 47, XY + 18
Para los estudios citogenéticos moleculares en espermatozoides se utilizó el siguiente protocolo:
Decondensación previa de los espermatozoides
El semen obtenido por masturbación se conservó en Test Yolk hasta su procesado. Se agregaron partes iguales de PBS a pH 7 Y sei ncubó 10 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugó a 500 G durante 5 minutos y al pellet se le agregó 2 ml de PBS conteniendo 6 mM de EDTA a pH 7. Se incubó 5 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugó nuevamente y al pellet se agregó 2 ml de DTT 2 mM en PBS y se incubó 45 minutos a 37 0C. Se celltrifugó nuevamente y el pellet fue resuspendido en fijador Carnoy y conservado en la heladera por 30 minutos. Se lavó dos veces en fijador fresco y se resuspendió en 0, 5 ml de fijador. Se obtuvieron los preparados con la técnica de secado al aire y se conservaron en heladera hasta la hibridación.
FISH
Para estimar la segregación del cuadrivalente meiótico se usaron tres sondas de dos colores de Vysis: sonda centromérica del cromosoma 1 conjugada con rojo, sonda centromérica del cromosoma 4 conjugada en verde, y sonda telomérica del brazo largo del cromosoma 4 conjugada en rojo.Para evaluar el efecto intercromosómico se usaron las sondas de los cromosomas 18, X e Y, conjugadas en azul, verde y rojo respectivamente y las sondas 13 y 21 conjugadas en rojo y verde respectivamente (Aneuvision de Vysis).
Pretratamiento de los preparados
Incubados en 2 X sse a pH 7 a 37° e durante 15 minutos
Incubados en Formol al I % en 2 X sse durante IS minutos a temperatura ambiente
Incubados en PBS a pH 7 durante 5 minutos a temperatura ambiente
Deshidratados por pasajes de 1 minuto en alcohol etílico de 70°, 85°, y 100°
Secados al aire.
Hibridación
Diez microlitros de mezclas de hibridación fueron adicionadas a los preparados precalentados a 45° e durante 2 - 4 minutos, cubiertas con cubreobjetos de 18 X 18 mm y selladoscon pegamento de goma. Los preparados fueron desnaturalizados a 68° e durante 8 minutos e hibridados durante 16 horas a 37° e en el HYBRITE (Vysis). Posteriormente fueron lavados 3 vezes por 10 minutos a 37° C en:
1° - formarnida al 50% en 2 X sse a pH 7
2°_ 2 X sse a pH 7
3°_ 2 X SSC con 0,1 % NP-40
4°_ PBS a pH 7 durante 5 minutos a temperatura ambiente
5°_ enjuagados en agua destilada.
6°_ Se dejaron secar al aire.
7°_ Se colorearon con 10 microlitros de DAPI II.
8°_ Se montaron con cubreobjetos de 24 X 24 mm.
Microscopía
Se usó un microscopio Nikon equipado con epifluorescencia con filtros simple, doble y triple para DAPI, FITC, y Texas Red. El análisis fue realizado con objetivos de inmersión 100X de fluorita bajo aceite libre de fluorescencia. Las señales fluorescentes con cada uno de los filtros simples fueron capturadas por una videocámara fria (Xillix microimager) y posteriormente compuestas con el software de imágenes Multifluor de BDI (Biological Detection Inc).
Criterios de Análisis
Para aneuploidías
Se registraron las señales fluorescentes de los núcleos de los espermatozoides decondensados. Se excluyeron los espermatozoides poco o muy decondensados, como así también los superpuestos y con bordes indefinidos. De acuerdo con los criterios de Martín & Rademaker (1995) dos señales de un mismo color separadas por una distancia menos que el diámetro mayor de uno de los dominios fue registrada como única señal. En cambio, se consideraron como dos señales de una misma sonda (disomía) sólo cuando los dominios de las señales eran de igual brillo y estaban separadas por una distancia mínima igual al diámetro de la mayor. La ausencia de señal de una sonda fue considerada como nulisomía para ese cromosoma. Los espermatozoides que no mostraron señal para ninguna de las sondas usadas no se registraron debido a que podían ser el resultado de falta de hibridación por inadecuada decondensación. Un espermatozoide fue considerado diploide cuando tenía dos señales de cada una de las sondas usadas.
Para la segregación del cuadrivalente
A diferencia de lo anteriormente mencionado, se consideraron como dos señales de un mismo color, a pesar de no estar separadas por una distancia superior que el diámetro de la señal de mayor tamano, debido a que una de las sondas utilizadas fue una sonda telomérica, por lo tanto teóricamente observable a poca distancia de los centrómeros de ambos cromosomas y con un tamano menor.. Se consideró a un espermatozoide como perteneciente a uno de los cuatro posibles patrones de segregación (Esquema I) cuando mostraron las siguientes señales:
Esquema I. Segregación del cuadrivalente t(1; 4) (p32; q25)
Alternada: tres señales, una señal verde y dos rojas, siendo una de menor tamano, con cromosomas 1 y 4 normales cuando la señal roja de menor tamano estaba ubicada cerca de la seõal verde. Con ambos cromosomas translocados (equilibrados) cuando las dos señales rojas estaban ubicadas a poca distancia.
Adyacente I: cuatro señales, una verde y tres rojas, dos de ellas de menor tamafío, o bien dos señales, una roja y otra verde.
Adyacente II: tres seõales rojas, siendo una de menor tamano, o bien tres señales, dos verdes y una roja pequena.
Segregación 3:1:
a) Dos señales, una verde y otra roja de tamano pequeno, o bien cuatro señales, una verde y tres rojas, siendo una de las rojas más pequena.
b) Una señal verde o bien cinco señales, una verde y cuatro rojas, siendo dos de las rojas más pequenas.
c) Dos señales rojas, siendo una más pequena, o bien cuatro señales, dos verdes y dos rojas, siendo una de las rojas de menor tamano.
d) una señal roja o bien cinco señales, dos verdes y tres rojas, siendo dos de las rojas más pequenas.
Segregación 4:0:
Seis señales, dos verdes y cuatro rojas, siendo dos de las rojas más pequeõas, o bien sin señales en un área de buena hibridación.Se excluyeron todas las demás señales que no fueron anteriormente mencionadas como las correspondientes a los errores de no disyunción de la segunda división.La segregación 4:0 fue constatada, aunque no se la consideró en los cálculos debido a que podía corresponder el rnismo patrón a una diploidía o a una célula somática. Solo se consideraron a los núcleos con patrón de segregación 4:0 a aquellos con seis señales y se los multiplicó por dos debido a que el patrón sin marcas podría deberse a falta de hibridación.
Analisis de los datos
1.. Se aplicó el test derivado del cociente de maxlma verosirnilitud (Test G) para estimar las diferencias significativas entre los porcentajes hallados de los cromosomas evaluados con las sondas 13, 18, 21, X e Y.
2. Para estimar la constitución normal de los espermatozoides luego de ser evaluados con las
mencionadas sondas, se utilizó la fórmula: P= Ps x (Pr)22 Siendo: Ps = % de espermatozoides con cromosomas sexuales normales
Pr = probabilidad de normalidad de los restantes cromosomas no evaluados, estimada con la media geométrica de los cromosomas normales estudiados, con la fórmula: Pr = (P13 X P18 X P21 )1/3
1. Para calcular la eficiencia diagnóstica del futuro DGP con el estudio de las sondas propuestas, se
utilizó la fórmula: P = (NIE) = P(N _ E)/PE
Siendo: N = % de normales no estudiados.
E = % de normales estudiados.
Resultados
En la Tabla I están registrados los porcentajes de los diferentes patrones de segregación del cuadrivalente (Alternada, Adyacente I, Adyacente II y 3: 1) evaluados con sondas centroméricas de los cromosomas 1 y 4 Y con sonda telomérica del brazo largo del 4 (Figs. 3, 4, 5, 6 y 7). Se excluyó a la segregación 4:0 por no poder di ferenciarla de los espermatozoides diploides y/o de las células somáticas.
Tabla I. Patrones de segregación del cuadrivalente t(1; 4) en espermatozoides
Fig. 3. Espermatozoide decondensado hibridado con sondas centroméricas de los cromosomas 1 (señal roja) y 4 (señal verde) y sonda telomérica 4q (señal roja más pequeiía). Las señales fluorescentes corresponden a un patrón de segregación alterna.
Fig. 4. Espermatozoide hibridado con sondas centroméricas de los cromosomas 1 y 4 y telomérica 4q. Las señales fluorescentes corresponden a un patrón de segregación adyacente I.
Fig. 5. Espermatozoides hibridados con sondas centroméricas 1 y 4 Y telomérica 4q. Las señales fluorescentes corresponden a un patrón de segregación adyacente II.
Fig. 6. Dos espermatozoides, uno decondensado, hibridado con sondas centroméricas 1 y 4 Y telomérica 4q. Las señales fluorescentes corresponden a un patrón de segregación 3: 1.
Fig. 7. Dos espermatozoides, uno decondensado, hibridado con sondas centroméricas 1 y 4 Y telomérica 4q. Las señales fluorescentes corresponden a un patrón de segregación 4:0.
El porcentaje de espermatozoides con segregación alternada o normal fue 24, 0%, correspondiendo el 9, 7% a la segregación de los dos cromosomas 1 y 4 normales, y 14, 3% a la de los cromosomas 1 y 4 translocados (equilibrados).
En la Tabla II están registrados los porcentajes de aneuploidía (nulisornía + disornía) de los cromosomas 13, 18, 21 Y sexuales evaluados con dos mezclas de sondas, una triple (l8, X, Y) y una doble (13, 21) (Figs. 8, 9, 10, 11, 12 y 13). EI porcentaje de aneuploidía para los cromosomas 13, 18, 21 y sexuales fue: 21 , 5%, 15, 2%, 31 , 0% y 28, 2%, respectivamente.
Tabla II. Porcentaje de aneuploidía de los cromosomas 13, 18, 21 y sexuales
Fig. 8. Espermatozoides decondensados hibridados con la mezcla de sondas de los cromosomas 18 (señal azul), X (señal verde) e Y (señal roja). Las señales fluorescentes corresponden a cinco espermatozoides con complemento 18, X e Y normales.
Fig. 9. Espermatozoide decondensado hibridado con la mezcla 18, X e Y. La señal fluorescente corresponde a un espermatozoide nulisómico para el cromosoma sexual.
Fig. 10. Espermatozoide decondensado hibridado con la mezcla 18, X e Y. Las señales fluorescentes corresponden a un espermatozoide disómico X Y.
Fig. 11. Espermatozoides hibridados con la mezcla 18, X e Y. Las señales fluorescentes de los espermatozoides corresponden a una: diploidia (A), disomía (B) y normal (C).
Fig. 12. Espermatozoide hibridado con la mezcla 18, X e Y. Las señales fluorescentes corresponden a un espermatozoide con trisomía 18, disomía X y disomía Y.
Fig. 13. Espermatozoides hibridados con la mezcla 18, X e Y. Las señales fluorescentes de los espermatozoides corresponden a una: disomía XY (A) Y diploidia (B).
Fig. 14. Espermatozoides hibridados con la mezcla de sondas 13 (señal roja) y 21 (señal verde). Las señales fluorescentes corresponden a espermatozoides con complemento 13, 21 normales.
Fig. 15. Espermatozoide hibridado con la mezcla 13, 21. Las sefiales fluorescentes corresponden a un espermatozoide disómico 21.
Fig. 16. Espermatozoide hibridado con la mezcla 13, 21. Las señales fluorescentes corresponden a un espermatozoide disómico 13.
En la Tabla III están registrados los porcentajes de espermatozoides diploides evaluados con las dos mezclas de sondas, 18 , X, Y, y 13 , 21, respectivamente. El porcentaje promedio de diploidía fue: 11, 2%
Tabla III. Porcentaje de diploidia evaluado con dos mezclas
El Test G evidenció diferencias significativas entre los porcentajes de anormales para todos los cromosomas estudiados (P<0.0001) La estimación de la normalidad de los espermatozoides luego de ser evaluados con las sondas utilizadas fue: 1, 13%. Teniendo en cuenta el importante efecto intercromosómico, decidimos calcular la eficiencia diagnóstica del futuro DGP con el estudio de las sondas propuestas y asumiendo que los óvulos son normales, los resultados del mismo san los siguientes:
1. Si el estudio de la blastómera con las sondas centroméricas de los cromosomas I y 4 y la telomérica 4q es normal, la probabilidad de que el embrión sea normal es 5, 42%
2. Si se estudiara además con las sondas 13 y 21, y diera normal, la probabilidad de que el embrión fuera normal sería 10%.
3. Si también se estudiara con las sondas 18, X e Y, y diera normal, la probabilidad de que el embrión fuese normal sería 16, 43%.
Como la eficiencia diagnóstica, a pesar de utilizar ocho sondas es baja, la pregunta lógica sería l, Cuántos embriones hay que estudiar para obtener una probabilidad de normalidad satisfactoria?.
En la Tabla IV figuran los valores de normalidad de acuerdo ai número de embriones estudiados con las ocho sondas.
Tabla IV. Probabilidad de que al menos un embrión sea cromosomicamente normal cuando la evaluación con las 8 sondas dió normal
Discusión
En época pre FISH, en la década pasada, varios autores han brindado información sobre la constitución cromosómica de espermatozoides provenientes de hombres heterocigotas para translocaciones recíprocas, usando la técnica de estudio de los pronúcleos en ovocitos de hamster inseminados o inyectados con espermatozoides humanos. Todas las segregaciones teóricas fueron observadas en los portadores, muchas de ellas raramente observadas en estudios de recién nacidos y abortos espontáneos. Martin en 1990 haciendo una revisión de la l iteratura encontró que la frecuencia de espermatozoides desequilibrados en portadores de translocaciones variaba entre un 19 y 77%, correspondiendo un 23-78% para la segregación alternada, 16-23% para la adyacente I, 0-24% para la adyacente II, 0-25% para la segregación 3: 1 y 0-4% para la segregación 4:0. La gran variación observada puede deberse ai comportamiento de las diferentes translocaciones, pero también es cierto que con esa técnica el número de espermatozoides cariotipados fue limitado.
Como en progenitores de ninos con trisomías a menudo se han encontrado reordenamientos equilibrados, se sugirió que 110s portadores de los mismos tienen riesgo aumentado para tener ninos con aneuploidías debido ai efecto intercromosómico de la anomalía estructural sobre el apareamiento y disyunción de otros cromosomas. (Aurias et al 1978; Gallego & Coco 1988) La posibilidad del cariotipado de espermatozoides entusiasmó a varios autores para evaluar la existencia del mismo. Sin embargo, en la mayoría de los estudios realizados no se pudo observar el efecto intercromosómico, indicando que ese fenómeno podría ocurrir para algunas anomalías estructurales. Pero como el cariotipado de espermatozoides en la mayoría de los estudios estuvo limitado a un escaso número de espermatozoides, la ausencia del mismo pudo deberse a la difi cultad de su detección.
Una alternativa que obvia la necesidad de fecundar a los ovocitos de hamster y que brinda la posibilidad de estudiar a un mayor número de espermatozoides es el estudio citogenético molecular de los espermatozoides con la técnica de hibridación.in situ fluorescente (FISH). La gran desventaja, debido a que aún no es factible analizar a todos los cromosomas de una célula, es que sólo pone en evidencia a un limitado número de cromosomas.
En el presente trabajo decidimos estudiar el comportamiento de la segregación del cuadrivalente meiótico con tres sondas, que a posteriori, usaríamos en el DGP, de manera que nos permitiera evaluar sin dificultades en las blastómeras de los embriones biopsiados cuales habían heredado la segregación normal de los cromosomas involucrados en la translocación. Las sondas elegidas fueron centromérica del cromosoma I, centromérica del cromosoma 4 y telomérica del brazo largo dei cromosoma 4. Las mismas fueron probadas en los espermatozoides del portador de la translocación t(I, 4) por considerar que era el modelo más apropiado para ensayar el futuro DGP y además recabar infórmación sobre los patrones de segregación del cuadrivalente para estimar el riesgo genético reproductivo. Las sondas elegidas cumplieron con nuestras expectativas, además de poder distinguir la segregación normal de las anormales, permitió diferenciar dentro de la segregación alternada aquellos espermatozoides con cromosomas 1 y 4 normales de los que tenÍan ambos cromosomas translocados equilibradamente, de acuerdo a que la señal roja más pequena estuviera cerca de la señal verde que de la señal roja grande, respectivamente. La proporción encontrada para cada uno de los diferentes patrones de segregación fue: 24.0% para la alternada, 26.4% para la adyacente I, 11.4% para la adyacente TI y 38.2% para la 3: I. Además la proporción de normales y equilibrados en la segregación alternada fue similar. En la literatura existen 13 translocaciones recíprocas estudiadas con FISH (Tabla V), pero sólo en 7 de ellas, de acuerdo con las sondas utilizadas, se pudieron estimar los diferentes patrones de segregación como en el presente estudio. En estas últimas los patrones variaron desde 27.4 a 49.7% para la segregación alternada, de 15.9 a 42.5% para la adyacente I, de 3. 1 a 16.2% para la adyacente TI y de 1.7 a 40. 1 % para la segregación 3: I. En cambio en las restantes 6 translocaciones documentadas los autores no pudierbn distinguir entre segregación alternada y adyacente I. Habiendo; concluído que las sondas centroméricas de los cromosomás 1 y 4 conjuntamente con la telomérica 4q serían las adecuadas para el futuro DGP decidimos además, evaluar si el cuadrivalente podía interferir sobre la separación de los cromosornas 13, 18 , 21, X e Y. La proporción de espermatozoides, normales para los cromosomas estudiados fueron 78.5%, 84.8%, 69.0%, 71.8% respectivamente.
Tabla V. Estimación de los patrones de segregación y efecto intercromosómico en portadores de translocaciones por FISH
De las 13 translocaciones documentadas estudiadas con FISH, sólo en 7 se evaluó el efecto intercromosónrrco y en dos de ellos se constató dicho fenómeno para el par LEn el presente estudio, en cambio se pudo determinar un muy importante efecto intercromosómico para los cromosomas 13, 18, 21 y sexuales, comparado con nuestros controles y con los de la literatura (Pang et al. 1999). Por lo tantô, en el futuro DGP para ganar la máxima eficiencia diagnóstica, no solamente se tendría que estudiar a los cromosomas involucrados en la transloéacion sino por lo menos los correspondientes a las aneuploidías más viables y frecuentes. Sin embargo, en este particular caso, por el importante efecto intercromosómico observado, aunque se realizara el DGP con las ocho sondas propuestas, la eficiencia diagnóstica del mismo sigue siendo baja, la cual fue estimada en 16, 43%. Dicho de otra manera, en el futuro DGP, aunque se asevere la falta de anomalias para los cromosoinas estudiados, sigue habiendo una probabilidad alta de anomiáíidad para los restantes cromosomas no estudiados, aunque también es derto que la letalidad temprana para esos cromosomas esmuy álta. Por otro lado, para lograr una eficiencia reproductiva adécuada se deberían obtener varios embriones normales con el FISH realizado y la mujer admitir ser transferida, por lo menos con tres de ellos, para tener mayor probabilidad de que por lo menos uno de ellos sea totalmente normal.
Si bien es cierto que la información que brinda el FISH está limitada a los brorriosomas estudiados, es el mejor estudio disponible en la ectualidad para evaluar el riesgo reproductivo asociado con los portadores de translocaciones y para la investigación de los mecanismos de segregación meiótica de los cromosomas.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Dra. Delia Garrido por el análisis minucioso de los resultados; a la estudiante Claudia Sartori por su entusiasta colaboración en el trabajo y por la realización de los esquemas didácticos; a la Lic. Judith Mincman por su criteriosa evaluación; a Martin Urquiza y Carlos Peuchot por la transcripción y diagramación del mismo.
Referências