JBRA Assist. Reprod. 2000;04(02):60-63
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2000.4.2.03
Avaliação cromossômica de homens inférteis antes da injeção intracitoplasmática de espermatozóides
Chromosome evaluation of infertile men prior intracytoplasmatic sperm injection
Resumo
A injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) veio solucionaro problema de homens inférteis, mas levou a um questionamento em tomo de prováveis implicações genéticas e a possível herança destas aos seus descendentes. Foi realizada análise cromossômica em linfócito de sangue periférico pela técnica de bandeamento G, em 56 homens inférteis (11 azoospérmicos e 45 oligoastenospérmicos) antes do ICSI.
Dois pacientes (3.75%) eram portadores de Síndrome de Klinefelter, 47, XXXY e um paciente (1 .79%) era portador de translocação Robertosoniana, 45, XY, t (13; 14), (11 p; 11 q). Recentes relatos mostraram que estes tipos de alterações cromossômicas estão particularmente relacionadas a pacientes com infertilidade masculina e, podem levar à graves consequências clínicas. Portanto o diagnóstico cromossômico e o aconselhamento genético devem ser realizadas nestes casais antes de se submeterem ao tratamento com reprodução assistida. O diagnóstico pré-natal também deve ser recomendado. Este tipo de conduta ajuda a diminuir a taxa de insucesso do tratamento, perdas gestacionais e evita a herdabilidade destas alterações de forma prejudicial aos descendentes.
Unitermos: infertilidade masculina, ICSI, cariótipo
Abstract
The intracytoplasmatic sperm injection (ICSI) carne to solve the problem of in fertile men, but it carne into question concerning the probability of genetic implications and the possible inheritance of these by their offspring. Chromosomal analysis was performed on cultured peripheral Iymphocytes by G-banded chromosome preparations, in 56 infertile men (11 azoospermic and 45 oligoastenospermic) prior ICSI treatment. Two patients (3.57%) were carrier of Klinefelter's syndrome, 47, XXY and one patient (1.79%) was carrier of Robertossonian translocations, 45, XY, t (13; 14), (11 p; 11 q). recent reports showed that these types of chromosomal alterations are particulary related to male infertility and it can lead to serious clinical consequences. Therefore, the chromosomal diagnosis and the genetic counselling must be accomplished in these couples prior to the intracytoplasmatic sperm injection treatment. The prenatal diagnosis also must be recommended. This kind of procedure help to reduce the insuccess rate of the treatment, abortions and it also avoids the inhefitance of these chromosomal alterations in a harmful manner by the offspring.
Key words: karyotype, intracytoplasmatic sperm injection, male infertility
Introdução
A reprodução assistida, desde seu nascimento, tem evoluido com o intuito de melhorar a taxa de gravidez, até o momento insatisfatória. Dentre os casais que necessitam de tratamento, os de piores prognósticos tem sido até recentemente os casos de infertilidade masculina. Com o uso da técnica de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) este problema foi parcialmente solucionado tornando a taxa de fertilização de pacientes oligoastenospérmicos semelhante a de pacientes com sêmen dentro dos parâmetros normais (Montag et al., 1997). O uso de espermatozóides e espermátides originários do ejaculado, do epidídimo ou da biópsia testicular no emprego do ICSI, transformou potencialmente a possibilidade de obter-se fertilização para estes casais (Chandley & Hargreave, 1996; Bernabeu et al., 1998). Entretanto, isto levou a um questionamento em torno de prováveis implicações genéticas destes pais, que recorrem ao tratamento de infertilidade, de apresentarem ou de estarem mais susceptíveis a originarem , no decorrer da espermatogênese, espermatozóides, portanto alterações genéticas e a passagem destas para os seus descendentes (Silber et al., 1995). Diante destes questionamentos passou-se a submeter estes pacientes a exames citogenéticos para verificar quais os tipos de alterações genéticas que poderiam estar presentes no cariótipo.
Alterações cromossômicas estão presentes em 6-7% dos pacientes com azoospermia e oligoastenozoospermia. No entanto, mesmo estes pacientes apresentando cariótipo de sangue periférico normal, 46, XY, não se exclui a possibilidade da presença de anormal idades cromossômicas nos espermatozóides (Rubio et al., 1999). A al teração cromossômica constitucional mais comum encontrada entre estes pacientes é uma aneuploidia que envolve os cromossomos sexuais. Onde o homem apresenta o cariótipo 47, XXY. Esta alteração cromossômica está associada a Síndrome de Klenifelter, sendo uma das características desta síndrome a presença de distúrbio na produção espermática, com o paciente apresentando azoospermia ou oligospermia. A frequência desta síndrome é de 0. 1 % na população geral e entre os pacientes com infertilidade sobe para 11 % dentre os aioospermícos e 0.7% dentre os oligospérmicos (Okada et al., 1999). No entanto, existem relatos recentes de pacientes com Síndrome de Klinefelter que conseguiram ser pai de criança normal através da reprodução assistida, aumentando assim o interesse dos esterileutas em tais pacientes -(Bourne et. al., 1997; Hinney et al., 1997; Reubinoff et al. 1998).
Um segundo grupo de homens com infertilidade que possuem o risco de passar uma alteração cromossômica não balanceada para sua progénie, é o dos portadores de rearranjos cromossômicos estruturais tais como: translocações, inserções, inversões ou cromossomos em anel estão associados ao distúrbio espermático destes pacientes (Giltay et al., 1998; Int Veld et al., 1997).
No presente estudo, apresentamos os achados citogenéticos entre o grupo de casais em que o homem possui distúrbios espermáticos e que recorreram ao nosso serviço para tratamento de infertilidade utilizando reprodução assistida.
Materiais e Métodos
Dentre os casais que vieram a MATERBABY - clínica de ginecologia reprodução humana e genética - em busca de tratamento para infertilidade, 56 apresentavam infertilidade masculina de acordo com os padrões da Organização Mundial da Saúde, azoospermia ou oligoastenospermia. Nos 56 homens foi realizado cariótipo de sangue periférico antes de serem submetidos ao ICSI.
A coleta foi feita por punção da veia periférica do braço, utilizando-se para tanto seringas hipodérmicas descartáveis contendo 0.25 ml de anti-coagulante (Liquemine-Roche)/ 5ml de sangue. O sangue periférico total era incubado em meio RPMI 1640 (Nutricel, Campinas-SP, BR.) suplementado com 2% de solução de fitohemaglutinina (Gibco-BRL, NY USA) e 20% de soro fetal bovino (Nutricel, Campinas-SP) a 37° C por 72h. Para obtenção de metáfases o ciclo celular foi sincronizado pela incubação da cultura com 3.2 µg de colchicina (Nutricel, Campinas-SP, BR) por 1 hora antes do término do tempo de cultura. As células foram então incubadas em solução hipotônica (KCl:C6H5Na307.2H201 %, 3: 1) por 25 minutos e fixadas em solução de Carnoy (ácido acético: metanol, 1 :3). A suspensão contendo as células era gotejada em lâminas de vidro previamente limpas, e deixadas para secar ao ar. Uma delas foi submetida a coloração convencional para contagem cromossômica com solução de Giemsa 10% em solução tampão fosfato (solução tampão: solução A- Na2 HP0412H20: solução BKH2P04, 1: 1) por 5 minutos, em seguida lavada em água corrente e deixada para secar ao ar. As lâminas restantes foram submetidas a técnica de banda G, para a análise morfológica dos cromossomos. Estas foram imersas em solução tampão fosfato com tripsina 2.5% (Gibco- BRL, NY, USA) no banho-maria a 37° C por 5 segundos e em seguida foram lavadas em solução de cloreto de sódio 0.9%, para obtenção das bandas.
Findo o procedimento, as lâminas foram coradas com solução de Giemsa 10% em solução tampão fosfato por 5 minutos. Lavadas em água corrente e deixadas para secar ao ar.
As metáfases foram analisadas sob microscópio óptico (Olympus BX60), com aumento de 100X e auxílio de um software para análise de imagens (Image-Pro Plusl Media Cybernetics), sendo estas capturadas através de uma câmera (COHU) conectada ao microscópio. Normalmente, foram analisadas 20 metáfases, sendo 10 com coloração convencional e 10 com coloração para bandeamento G. Todos os pacientes portadores de alterações citogenéticas foram encaminhados ao aconselhamento genético para orientação sobre o resultado encontrado e as implicações para os seus descendentes.
Resultados
Dos 56 homens inférteis referidos em nosso estudo, 11 eram azoospérmicos e 45 eram oligoastenospérmicos. A avaliação cromossômica destes pacientes mostrou alterações cromossômicas envolvendo o cromossomo sexual X, os quais apresentaram o cariótipo 47,XXY Síndrome de Klinefelter (fig. I) em 02156 pacientes (3,57 %). Em 1/560 ,79 %) pacientes foi encontrada uma alteração estrutural e numérica, translocação Robertsoniana envolvendo os cromossômos autossômicos 13 e 14, com cariótipo 45,XY, t (13 , 14) (P 11 ;q11) (fig. II), e os outros 53/56 (94,64 %) pacientes apresentaram cariótipos normais 46,XY. Os resultados obtidos na avaliação citogenética estão resumidos na Tab.1.
Tab. I. Perfil cromossômico dos pacientes com infertilidade masculina.
Discussão
Este estudo resume o perfil citogenético de nossos pacientes que apresentaram azoospermia e oligoastenospermia como causa da infertilidade masculina, e mostra o valor potencial da avaliação citogenética para afastar ou confirmar a hipótese de alteração cromossômica como causa da infertilidade.
Para uma interpretação clínica é necessário separar estes achados pelo tipo de anormalidades detectadas e pelo risco que os diferentes tipos de cariótipos alterados oferecem para os descendentes, o que depende do tipo de aberração cromossômicá herdada (Int Veld et al., 1997).
A taxa de alterações cromossômicas encontradas em nossos pacientes foi de 5,36% (3/56). Sendo que a translocação Robertsoniana foi encontrada em 1 ,79%, e é tida como uma alteração de risco baixo a moderado para um descendente viável com cariótipo não balanceado. Entretanto a translocação Robertsoniana pode levar a dissomia uniparental (UPD) no descendente. Apesar de não existirem ainda dados disponíveis, esta pode levar a sérias consequências clínicas. Isto é particularmente verdade para dissomia uniparental dos cromossomos 14 e 15. Por isso os pacientes com translocação Robertsoniana para os cromossomos 13; 14, 13;15 ou 14; 15 devem ser alertados no aconselhamento genético sobre o aumento de risco para perdas gestacionais espontâneas, além de pequena a moderada probabilidade de ocorrer disso mia uni parental ou aneuploidia no descendente viável. O diagnóstico pré-natal incluindo teste para dissomia uniparental é recomendado para estes casais. Em termos de importância reprodutiva, as translocações cromossômicas autossômicas balanceadas têm sido também relacionadas a pacientes com infertilidade, particularmente infertilidade masculina (Stern. et al., 1999).
As translocações cromossômicas recíprocas precisam ser avaliadas em cada caso. Para muitos pacientes a consequência mais séria da anormalidade cromossômica não é a perda gestacional espontânea, mas o nascimento de criança com alteração cromossômica desvantajosa. Apesar do alto risco de anormalidade nos portadores de translocações recíprocas, foram relatadas 5 gestações onde a anomalia parental (duas inversões, duas transl ocações Robertsonianas e um cromossomo marcador) foi herdada pelos fetos na forma balanceada (Meschede et al., 1998). No entanto, a presença de translocação não balanceada em alguns gametas pode predispor à falha na implantação ou no desenvolvimento do embrião, e aumentar o risco de insucessos no tratamento com fertilização assistida. Yoshida et al. (1997) compararam taxa de fertilização, taxa de clivagem embrionária, e gravidez por ICSI, entre dois grupos de casais. No grupo I os homens apresentavàm anormalidades cromossômicas estruturais, sendo 2 casos de translocação Robertsoniana, 3 de translocação recíproca e um de translocação recíproca com inversão do cromossomo 9 como variante normal. No grupo II todos apresentavam cariótipo normal, 46, XY servindo como grupo controle. Houve diferença estatisticamente significante somente na taxa de fertilização, sendo maior no grupo I que no grupo II. As outras taxas não mostraram diferenças estatisticamente significantes. Em 2 ciclos de ICSI de pacientes com translocação Robertsoniana, apesar de terem resultado em gravidez, ambos terminaram em abortamento em torno da quinta semana. Baschat et al. (1996) relataram uma gravidez de gêmeos onde uma das crianças mostrou ter herdado translocação recíproca de forma não balanceada do pai. Meschede et al., 1997 também relataram gestação onde um dos gêmeos herdou uma translocação cromossômica não balanceada apresentando trissomia quase completa para o braço curto do cromossomo 9. A importância do papel do cromossomo sexual na infertilidade masculina está refletida na alteração cromossômica encontrada. A alta frequência de anormalidades gonossomais detectada entre azoospérmicos é atribuída à síndrome de Klinefelter (47,XXY), a qual é a principal alteração cromossômica sexual encontrada entre homens c om in fertili dade. Anomalias envolvendo cromossomas sexuais são predominantes em azoospérmicos, enquanto que anomalias envolvendo cromossomos autossomos são mais frequentes em oligospérmicos. Num grande número de pacientes cariotipados, 10.728 homens, 3,5% apresentaram o cariótipo 47,XXY (Kleiman et al., 1999). Em nosso grupo de homens inférteis 3,57% eram 47, XXY. Okada et al. (1999) relataram que entre 1987 pacientes, 148 eram portadores da síndrome de Klinefelter, dentre estes, em 146 a análise do ejaculado revelou azoospermia. Entretanto, foram encontrados espermatozóides em um paciente com o cariótipo 47,XXY, e em um paciente com um cariótipo mosaico 46,XY/47,XXY. Os espermatozóides foram encontrados em três de cinco análises e em uma de quatro análises respectivamente, e a coloração com eosina revelou que s omente 5% dos espermatozóides encontrados no paciente não mosaico estavam vivos. A azoospermia não é uma característica consistente da síndrome de Klinefelter. Muitos pacientes com esta síndrome mostram aplasia germinal ao exame histológico, enquanto que alguns pacientes mosaicos mostram espermatogênese focal. Somente uns poucos casos de indivíduos aparentemente não mosaicos tinham m ostrado espermatogênese focal histologicamente. Entretanto foram encontrados espermatozóides no ejaculado ou nos testículos de 4 entre 9 pacientes com esta síndrome (Tournaye et al., 1996). Para determinar se estes espermatozóides ou espermátides são viáveis é necessário o estudo meiótico destes. Com a introdução da técnica de FISH, atualmente já existem relatos de que em 92% dos espermatozóides nucleados de pacientes com cariótipo 47,XXY podem ter cariótipo 23,X ou 23,Y, mas a taxa de hiperploidia para o cromossomo sexual tais como 24,XX ou 24,XY, é significantemente alta. Teoricamente se os espermatozóides deste paciente forem utilizados para o tratamento de infertilidade com reprodução assistida, utilizando ICSI, o risco de progênie XXY ou XXX é aumentado. Porém, gestações com nascimento de crianças normais, em algumas instituições tem encorajado alguns casais portadores da síndrome de Klinefelter a submeterem-se ao tratamento, mas o aconselhamento genético para tais casais é indicado (Okada et al., 1999). É prudente oferecer o diagnóstico pré-natal a todos os casais que se submeterem ao tratamento de infertilidade, independente do tipo de método utilizado (FIV ou ICSI), além de também informá-los dos riscos antes de decidirem sobre o tratamento. Após a gravidez alcançada, a maioria dos casais não está preparada para colocar a gravidez sob o risco, pequeno mas constatado, de executar o exame pela punção de líquido amniótico ou pela biópsia de vilo corial (Munné et al., 1998; Giltay et al., 1999). Em conclusão, este estudo mostrou a importância da avaliação citogenética nos casos de infertilidade masculina, já que existe a possibilidade, pequena mas constatada, de estes apresentarem alteraçõescromossômicas como causa da infertilidade. Além disto, acreditamos também ser necessário o aconselhamento genético e diagnóstico pré-natal para os casais que se submetem ao tratamento com reprodução assistida. Este tipo de conduta pode levar à diminuição na taxa de insucesso do tratamento, perdas gestacionais, e, ainda evitar a herdabilidade destas alterações de forma prejudicial aos descendentes.
Chandley A. C., Hargreave T. B. - Genetic anomaly and ICSI. Hum. Reprod., 17 :930-932, 1996