JBRA Assist. Reprod. 2000;04(02):71-77
ATUALIZAÇÃO
doi: 10.5935/1518-0557.2000.4.2.05
Papel das metaloproteinases nos mecanismos de implantação embrionária em humanos
Role of metaloproteinases in human embrionic implantation mechanisms
1Departamento de Tocogi necologia da Faculdade de Ciências Médicas de Minas Gerais
2Departamento de Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG
3Clínica ORIGEN - Centro de Medicina Reprodutiva - Belo Horizonte, MG
4Departamento de Ginecologia e obstetrícia da Faculdade de Medicina da UFMG
Resumo
Implantação é um processo progressivo onde o embrião tem que se apor e se aderir ao endométrio materno e posteriormente invadí-lo. A comunicação entre endométrio matemo e embrião ainda é um enigma em medicina reprodutiva. A penetração das células trofoblásticas no endométrio não é devida a uma pressão de crescimento passiva, mas sim a um processo bioquímico ativo, onde uma célula se tornainvasiva pela sua capacidade de produzir proteases. As metaloproteinases são proteases de membrana, que parecem atuar, quando ativadas, em forma de cascata, semelhante ao processo de coagulação sanguínea.
Unitermos: implantação embrionária, metaloproteinases, endométrio
Abstract
Implantation is a progressive process where an embryo needs to apose and adhere to the maternal endometrium, invading it. Communication between endometrium and embryo is still a mistery in reprod uctive medicine. Penetration of trophoblastic cells in the endometrium is not due to a passive growth pressure, but to an active biochemical process, where one cell becomes invasive according to its capacity to produce proteases. Metaloproteinases are membrane proteases that apparently act, when activated, similarly to blood clotting process, in a cascade reaction.
Key words: human implantation, metaloproteinases, endometrium
Introdução
As taxas de gravidez obtidas em ciclos de tratamento com técnicas de Reprodução Assistida permanecem baixas, apesar de toda evolução obtida nas últimas décadas, e o processo de implantação embrionária ainda é o principal fator limitante. A implantação clínica em humanos tem uma eficiência de aproximadamente 30%, se considerarmos que apenas um embrião está presente em ciclos naturais. A responsabilidade por esta baixa eficiência no processo de implantação pode ser dividida entre o embrião (30% dos blastocistos são morfologicamente anormais no momento da implantação in vivo), e um diálogo defeituoso entre o embrião e o endométrio, uma vez que 30% das perdas gestacionais precoces ocorrem antes da época esperada da menstruação.
A eficiência da implantação embrionária em humanos é muito pobre quando comparada com outras espécies de animais e, mesmo com o uso de técnicas de reprodução assistida, ela ainda é baixa. As taxas de implantação em programas de doação de oócitos encontram-se em torno de 18%, onde a reposição hormonal é usada para preparar o endométrio; e a implantação é ainda menos eficiente durante hiperestimulação ovariana controlada para fertilização in vitro, onde a taxa de implantação é ao redor de 12% por embrião, resultando em 30% e 50% de taxa de gravidez por transferência embrionária, respectivamente, de acordo com o número de embriões transferidos e a idade da paciente. Além disso, parece haver uma perda precoce ainda maior de embriões, que ocorre após o uso de técnicas de reprodução assistida, em comparação com ciclos não estimulados.
Aspectos básicos da implantação embrionária humana
A implantação embrionária é um processo progressivo onde o embrião tem que se apor e se aderir ao endométrio materno, e invadí-Io. O aspecto mais intrigante da implantação é que ela envolve dois participantes essenciais: o endométrio materno e o embrião. A comunicação entre eles e os efeitos recíprocos que um tem sobre o outro constituem um. paradigma ainda insolúvel em medicina reprodutiva. Este processo consiste na fixação do blastocisto ao endométrio materno, e requer um endométrio receptivo, um embrião funcionalmente normal no estágio de blastocisto, e um diálogo ou uma comunicação cruzada entre estes dois organismos imunológica e geneticamente diferentes. A implantação embrionária consiste de três fases distintas e consecutivas: aposição, adesão e invasão. Durante a aposição, o blastocisto encontra seu sítio de implantação, guiado para uma área específica do útero materno, geralmente na parede posterior, com seu polo embriônico direcionado para o epitélio endometrial superficial. A fase de adesão ocorre entre os dias 6 e 7 após a ovulação, quando ocorre um contato direto entre o epitélio endometrial e o trofectoderma do blastocisto. Finalmente, durante a invasão, o trofoblasto embrionário penetra e desloca o epitélio endometrial , destrói a membrana basal e é-introduzido dentro do estroma, invadindo até os vasos uterinos. O período de tempo em que este diálogo inicial pode acontecer é chamado de "janela de implantação" (dias 20 a 24 após menstruação), correspondendo ao período de máxima receptividade uterina quando um blastocisto extruído da zona pelúcida está presente (Figura 1).
FIGURA 1. *Fases da implantação embrionária.
Regulação endócrina e parácrina
O papel crucial dos hormônios esteróides para o preparo do endométrio para uma implantação embrionária eficaz está além de qualquer dúvida. Porém, é sabido que os hormônios esteróides não são os efetores finais, mas eles podem sim iniciar uma reação em cascata de eventos moleculares através de moléculas autócrinas e parácrinas, como quimiocinas, citocinas, fatores de crescimento, moléculas de adesão e proteinases invasivas, que se somam para os mecanismos moleculares íntimos de aposição, adesão e invasão.
Uma sequência de esteróides ovarianos induzindo produção de quimiocinas pelo epitélio endometrial e migração leucocitária para o endométrio é necessária para o sucesso da aposição. Durante a implantação, leucócitos, principalmente macrófagos e células T em humanos, e macrófagos e granulócitos em roedores, infiltram a decídua. A regulação do recrutamento leucocitário no tecido uterino durante a implantação parece ser regido por células do epitélio uterino que liberam uma onda de quimiocinas num padrão temporal preciso, sob a influência dos esteróides ovarianos e possivelmente fatores seminais. As moléculas implicadas incluem IL-8, CSF- 1, RANTES, MCP- 1 e GM-CSF. A modulação desta fase pode estar relacionada com localização anormal do embrião em gestações ectópicas e com placentação anormal.
As quimiocinas constituem a primeira onda de moléculas produzidas localmente, e são responsáveis pela indução de uma outra onda de citocinas, como: LIF (Fator Inibidor de Leucemia), IL- 1 (Sistema Interleucina- I), e HB-EGF ( EGF ligante a heparan), que são relevantes na fase de adesão na implantação. Uma hipótese geral foi postulada, onde citocinas como LIF, ILI, HB-EGF e possivelmente outras, assim como seus receptores específicos propriamente distribuídos ao longo do endométrio e do embrião', podem iniciar o reconhecimento mútuo do blastocisto a se implantar e do endométrio, ativando moléculas de adesão endorrtriais que permitirão um contato físico entre embrião e útero. A patologia desta fase é rotulada como infertilidade de etiologia desconhecida, falha de implantação após repetidas transferências embrionárias (em FIV ou em doação de oócitos) e perda gestacional precoce, antes da menstruação.
A invasão é um processo proteolítico auto-controlado. Oito dias após a ovulação, o blastocisto é alojado no estroma e o sítio de entrada é coberto com fibrina, sobre a qual crescem as células epiteliais. Na espécie humana, a membrana basal é a primeira barreira a ser transposta, e o trofoblasto deve invadir o compartimento estromal, para então penetrar nos vasos sanguíneos maternos. Esta ação é mediada por várias proteinases que degradam a Matriz Extracelular (ECM), como proteínas serinas, metal oproteinases e colagenases. Ativadores de plasminogênio tipo uroquinase (UPA) e tipo tecido (TPA) são proteases serinas que catalisam a conversão de plasminogênio em plasmina, com uma grande ação proteolítica, sendo capazes de degradar diretamente a matriz extracelular. As metaloproteinases matrizes (MMPs) são uma família de endopeptidases zinco-dependentes, com atividades proteolíticas contra vários componentes da matriz extracelul ar. A fam ília é composta por três grupos: colagenases, gelatinases e estromelisinas. Enzimas ativadas digerem as matrizes extracelulares, de acordo com a especificidade ao seu substrato. As colagenases incluem a MMP- 1 e a MMP-8. Estas enzimas digerem colágenos dos tipos I, II, III, VII e X. As gelatinases digerem colágeno do tipo IV, V, VII e proteoglicans. Uma regulagem delicada deste processo é necessária, para prevenir uma invasão excessiva patológica, como ocorre na placenta acreta, ou um invasão defeituosa, como na doença hipertensiva específica da gravidez.
Regulação Embrionária
Os hormônios esteróides maternos tem um papel importante em estabelecer a fase receptiva de implantação, e em preparar o endométrio em cada uma das fases mencionadas acima. A possibilidade de o embrião ser capaz de modular moléculas endometriais, autocontrolando o processo de implantação, é uma idéia óbvia e desafiante. A inter-relação entre embrião, endométrio e corpo lúteo é crucial no estabelecimento da gravidez em mamíferos. Em ruminantes, os sinais trofoblásticos embrionários atuam de forma parácrina no endométrio uterino, para inibir a liberação pulsátil de prostaglandina F2 alfa, fechando este sinal luteolítico e permitindo que o corpo lúteo seja formado. Em contraste, o sinal embriônico em primatas, a gonadotrofina coriônica, exerce um efeito luteotrófico direto no corpo lúteo, estendendo seu tempo de vida.
Focalizando nas interações embriônico-endometriais, foi demonstrado em roedores (ratos) que fator(es) embriônico(s) está(ão) envol vido(s) na aquisição da receptividade do epitélio superficial, mas o contato direto entre o embrião e o endométrio não é essencial. De fato, num estudo recente de Wakuda et al.,( 1999) demonstrou-se que embriões dentro do oviduto exercem um efeito biológico, enviando um sinal ao epitélio endometrial e estroma, facilitando assim a receptividade endometrial e melhorando as taxas de implantação. Este conceito crucial foi também demonstrado no coelho recentemente, e Fazleabas (1999) demonstrou, no primata não humano (Papio anubis), a modulação do endométrio uterino por gonadotrofina coriônica, durante o período de receptividade uterina. Neste estudo in vivo, os autores mostraram um efeito fisiológico da gonadotrofina coriônica no endométrio uterino, sugerindo que sinais do blastocisto do primata modulam o ambiente uterino antes e durante a implantação. Então, estes estudos sugerem fortemente que há uma terceira dimensão a ser considerada em estudos sobre implantação, e que há um efeito do embrião na regulagem da receptividade endometrial, aposição, adesão e invasão.
Em humanos, não há evidência direta sobre o papel do embrião humano na regulagem da receptividade endometrial, adesão ou invasão. De qualquer forma, informações indiretas obtidas de biópsias endometriais durante ciclos de concepção reforçam o conceito de regulação embriônica neste processo de implantação. Biópsias endometriais obtidas em duas séries clínicas, incluindo 18 e 54 pacientes durante um ciclo de concepção, mostraram um atraso histológico de dois dias, como comparados a ciclos de 25 dias de duração média. Em outras palavras, quando um embrião humano está presente, há um atraso no processo de decidualização. também, o estudo de um sítio de implantação numa gravidez humana normal revela transformações específicas na decídua, induzidas pelo embrião. No macaco rhesus, investigações similares suportam a hipótese de que mudanças diferenciais ocorrem no funcionamento do endométrio da fase lútea, na presença de um blastocisto.
Em outro estudo, foi desenvolvido um sistema de co-cultura com células epiteliais endometriais humanas autólogas (AEEC), que mantiveram muitos aspectos do epitélio endometrial humano. O modelo empregado foi baseado num programa de fertilização in vitro, onde embriões humanos foram individualmente co-cultivados com culturas primárias de AEEC até o estágio de blastocisto, e então, transferidos de volta ao útero. Os embriões foram obtidos após hiperestimulação ovariana controlada, e inseminados empregando procedimentos rotineiros de fertilização in vitro. Células epiteliais endometriais foram isoladas do endométrio de pacientes férteis, e cultivados até confluência, como descrito anteriormente. Embriões humanos individuais foram co-cultivados com AEEC por 5 dias (do dia 2 até o dia 6 do desenvolvimento embriônico). Após a transferência embrionária, poços com células epiteliais endometriais (EEC) foram divididos em três grupos diferentes, de acordo com o status embrionário alcançado: EEC com embriões que chegaram ao estágio de blastocisto, EEC com embriões que não progrediram, e EEC sem embriões (Figura 2).
FIGURA 2. * Fatores embrionários e endometriais ligados à invasão embrionários
Usando este modelo, foi estudada a regulação embrionária de moléculas epiteliais endometriais de adesão e anti-adesão, quimiocinas e cross-linkers de citoesqueleto de membrana. O blastocisto humano é capaz de regular para mais moléculas epiteliais endometriais de adesão, como : ð3 integrinas, mucinas como a MUCl , quimiocinas epiteliais endometriais como a IL- 8, e ezrina, um cross-linker de citoesqueleto de membrana no epitélio endometrial (Figura 3). As moléculas embrionárias responsáveis por estes efeitos endometriais merecem investigação.
Em conclusão, os sinais bidirecionais entre o embrião e o endométrio são um pré-requisito para a implantação embriônica normal, e esse novo campo constitui uma nova dimensão em estudos futuros sobre implantação.
Papel das metaloproteínases nos mecanismos de implantação embrionária em humanos
A penetração (oui nvasão) das células trofoblásticas no endométrio não é devida a uma pressão de crescimento passiva, mas a um processo bioquímico ativo. Uma célula se torna invasiva pela sua capacidade de secretar proteases, e células do trofectoderma não são exceção. Proteases serinas, catepsinas e metaloproteinases (MMP) estão envolvidas neste processo de invasão. As metaloproteinases formam uma família de enzimas homólogas, onde todas possuem um átomo de Zn++ no seu sítio ativo. Elas são secretadas como próenzimas inativas (zimógenas), que se tornam ativadas sob hidrólise parcial, quando perdem seu pró-peptídeo. A ativação de pró-MMPs em MMPs ativas pode ser produzida in vitro pela adição de diferentes agentes, como sais de mercúrio. Embora os ativadores fisiológicos de diferentes MMPs sejam ainda desconhecidos, foi demonstrado que a plasmina, MMP-3, e MMPs ligadas à membrana são ativadores potentes de várias MMPs. Isto significa que as MMPs atuam em cascata, de forma similar às enzimas envolvidas na coagulação sanguínea. As MMPs são classificadas em quatro subfamílias, de acordo com seu substrato específico: Gelatinases: são representadas por duas enzimas, gelatinase A e B. Estas proteases digerem colágeno tipo IV Colagenases: incluem três proteases: colagenase intersticial, colagenase neutrófila e colagenase 3.
Estas enzimas digerem colágeno tipo I, II, III, VII e X. Estromelisinas: são uma sub-família de quatro enzimas: MMP-3, -7, -10 e -11. Digerem colágenos tipo IV, V, VII, assim como laminina, fibronectina, proteoglicans e gelatina. Metaloproteinases de membrana: incluem três enzimas ligadas à membrana. Elas tem como substrato essencial as pró- MMP-2, que permitem a ativação de MMP-2 na superfície da célula no fronte de invasão.
A Tabela I mostra as diferentes metaloproteinases, com suas propriedades bioquímicas.
Tabela I. Propriedades biomédicas das metaloproteínases
Discussão
A implantação embrionária ainda representa um dos grandes impasses em Medicina Reprodutiva, na tentativa de se implementar as taxas de êxito nos ciclos de tratamento. Muito ainda falta para se conhecer e se entender a respeito dos processos bioquímicos, moleculares e imunológicos envolvidos nesta fase. O real papel das metaloproteinases está para se esclarecer, mas é inegável a participação de inúmeras outras substâncias para que a implantação se concretize.
Cawston T.E. Proteinases and inhibitors. Br Med Bull; 51 :385401, 1995.