JBRA Assist. Reprod. 2000;04(02):78-82
ATUALIZAÇÃO
doi: 10.5935/1518-0557.2000.4.2.06
Coleta de gametas
Collection of gametes
1CRHCentro de Reprodução Humana Fundação Maternidade Sinhá Junqueira
2Professor de Tocoginecologia do curso de Ciências Médicas da Universidade de Ribeirão Preto UNAERP
Resumo
O primeiro objetivo da fertilização "in vitro" é coletar óvulos e esperma. O artigo revisou os métodos de escolha para coleta feminina (punção laparoscópica, punção guiada por ultra-som transabdominall transvesical, periurethral/transvesical, e transvaginal) e masculino (masturbação, coleta de espermatozóide do epidídimo e do testículo e de distúrbios da ejaculação.
Unitermos: ICSI, coleta de gametas
Abstract
The first objective of "in vitro" fertilization is the collection of oocytes and spem. This article review the methods of choice for the collections of female (laparoscopic puncture; ultrasonographic puncture: transabdomina/trans vesical, periurethral/tranvesical, transvaginal and male (masturbation, sperm from epididymis, sperm from the testicle, sperm collections with disorders of ej aculation
Key words: ICSI, collection of gametes
O primeiro objetivo da fertilização "in vitro" (FIV) é a coleta de oócitos maduros. Em 1965, Edwards descreve pela primeira vez a tentativa de isolar oócitos humanos do ovário através da retirada de folículos por laparotomia e dissecção no laboratório. A técnica de coleta evoluiu para o processo de aspiração do líquido folicular, e subsequente, identificação em microscópio invertido. Inicialmente, a aspiração foi realizada por laparotomia, entretanto no fim dos anos 70, o procedimento cirúrgico padrão ficou restrito ao uso da laparoscopia. Do início dos anos 80 até hoje, a ultrasonografia evoluiu e se tornou o método de escolha para a coleta do gameta feminino.
Punção laparoscópica
A laparoscopia foi o método clássico introduzido pelos pioneiros da técnica de FIV (Steptoe and Edwards, 1970). Atualmente, as indicações para aspiração folicu lar por via laparoscópica estão praticamente restritas aos casos em que se deseja visualizar os órgãos pélvicos, e ao mesmo tempo, realizar um procedimento de transferência de gametas intratubário (GIFT) ou transferência de zigotos intratubário (ZIFT), tal situação ocorreria nos casos de esterilidade sem causa aparente (ESCA) ou em possível endometriose pélvica. Frequentemente, a paciente requer anestesia geral com entubação endotraqueal, executa-se um pneumoperitônio com C02 e realiza-se uma punção tripla. Os ovários são apreendidos por pinças especiais, tracionados e manipulados de modo que cada folículo seja puncionado com uma agulha de duplo lúmen, conectada a um tubo por tubulação de teflon. O conteúdo folicular é aspirado e o liquido folicular coletado é examinado em microscópio para a identificação dos oócitos e seu grau de maturidade. A paciente permanece internada no hospital por 24 horas. Entretanto, a laparoscopia apresenta inconvenientes como a morbidade cirúrgica e anestésica, necessitando de considerável aparato de suporte para sua realização.
Punção ultra-sonográfica: transabdominal / transvesical
Em 1981, Lenz et al. usaram a ultra-sonografia com guia para a agulha de punção, aspirando os folículos ovarianos por via percutânea e transvesical. A agulha de punção folicular penetra na pelve pela parede abdominal, atravessando a parede anterior e posterior da bexiga previamente cheia com 300 a 400 ml de soro fisiológico. As pacientes poderiam ser atendidas em regime ambulatorial, pois na maioria das vezes, apenas uma sedação discreta e anestesia local eram suficientes para o processo de coleta dos óvulos. Essa técnica representou um grande avanço na simplificação do processo de coleta de óvulos, permitindo a aspiração folicular em casos de aderências pélvicas, fato que de princípio contra-indicava o uso da laparoscopia. Entretanto, a técnica ainda apresentava alguns inconvenientes, como a dificuldade na visualização da ponta da agulha, que penetrava obliquamente ao transdutor e ao eixo ovariano, e o fato de ser ainda dolorosa pois não se podia anestesiar a parede vesical posterior e o peritônio visceral. Apresentou também algumas complicações, especialmente a hematúria pós punção. Naquela ocasião, os índices de recuperação dos oócitos giravam em torno de 57% por punção, e não foram observadas complicações graves no ato, exceto hematúria transitória em 10% das pacientes.
Em 1983, Wikland et al. demonstraram que não ocorria differença importante entre a captação por laparoscopia (oócitos recuperados, 86.4%, fertilizados 52%, transferência de embriões em 71 % dos casos) e a executada por ultrasom (oócitos recuperados 93%, fertilizados 58%, transferência de embriões em 71 % dos casos).
Punção ultra-sonográfica: peruretral / transvesical
Em 1985, Parsons et al. iniciaram a coleta de oócitos por via uretral. Nesse procedimento, a bexiga é cheia com solução salina e, após a sondagem vesical (cateter de Folley), uma agulha é introduzida através da própria sonda dentro da bexiga, que é transfixada, e a agulha penetra nos folículos ovarianos. O desconforto da repleção vesical e a hematúria, assim como a dor após o procedimento, tornaram essa via pouco utilizada com o advento do transdutor vaginal.
Punção ultra-sonográfica: transvaginal
Finalmente, a introdução da via vaginal foi sugerida por Gleicher et al., (1983), para se alcançar ovários altos na pélvis, ou fixados por aderências atrás do útero. Como os ovários estimulados estão aumentados de tamanho tal fato, colocaria os mesmos com maior frequência no fundo de saco, onde a punção transvaginal teria maior acesso. Entretanto, a punção com a mão livre através do fundo de saco vaginal não se mostrou de fácil execução em todos os casos. Em 1986, Feichtinger e Kemeter introduziram o transdutor vaginal que serviria de suporte para a agulha de punção. A compressão do fundo de saco vaginal lateral e posterior pelo transdutor vaginal permite que a agulha de punção aproxime-se do ovário, o que aumenta a eficiência do processo de coleta. Os transdutores vaginais de 5 a 7.5 MHz permitiram uma melhor imagem da pélvis, facilitando a visualização dos folículos e identificação de outras estruturas, especialmente dos vasos sanguíneos. Não há necessidade da bexiga estar cheia, o que diminui o desconforto e facilita o acesso aos ovários fixados
em posição superior na pelve. A agulha é acoplada ao transdutor, permitindo ao próprio cirurgião direcioná-la para a punção do folículo, aspiração e lavagem. Diversas agulhas, com diâmetros de 17-18 gauge são empregadas, o lúmen pode ser único ou duplo, a aspiração pode ser feita com uma seringa (10 ml) acoplada diretamente ou através de tubulação de Teflon ligada a uma tubo de Falcon e a uma bomba de aspiração controlada, como a de Craft. A taxa de recuperação de oócitos é alta, a anestesia pode ser apenas local ou, de preferência, acompanhada de sedação. A punção vaginal causa poucas complicações, exceto dor moderada ou discretas perdas sanguíneas de origem vaginal no pós-operatório imediato ou incomuns descrições de infecção pélvica pós-punção. Atualmente, esta é a técnica que mais utilizada. Os custos são reduzidos, podendo ser empregada de forma ambulatorial, é de fácil aprendizado e permite sua repetição com mais frequência.
Coleta do gameta masculino
Habitualmente, a coleta do sêmen é realizada através de masturbação em frasco estéril de vidro ou plástico, após um período variável de abstinência sexual de dois a quatro dias. Esta é a forma corrente de obtenção do esperma para inseminação artificial, FIV ou ICSI. Entretanto, Gerris (1999) acredita que a coleta de sêmen em preservativos de silicone durante o ato sexual produz amostras superiores as obtidas através da masturbação. Em casos de ejaculação retrógrada (neuropatia diabética, cirurgias pélvicas alargadas, etc) há necessidade de coletar os espermatozóides na urina, assim sendo usa-se o bicarbonato de sódio na concentração de 2g ao deitar e 2g pela manhã, ajustando-se o ph urinário para 7. Em seguida, após a masturbação colhe-se a urina em frasco estéril e atóxico, separando-se os espermatozóides através de centrifugação. Por outro lado, quando não há condições para esse procedimento, outros métodos são empregados (estimulação elétrica ou vibratória direta sobre a próstata ou pênis, punção das vias espermáticas, biópsia do testículo). Ocasionalmente, o ej aculado também poderá ser colhido de forma fracionada em placá com meio de cultura, especialmente em casos com presença de anticorpos antiespermatozóides.
Por outro lado, a ausência de espermatozóides no sêmen é chamada de azoospermia, fato que pode ocorrer em 10% dos homens que procuram uma clínica de infertilidade. o diagnóstico correto de azoospermia necessita do exame de pelo menos duas ejaculações e centrifugação do esperma em alta velocidade (1800 g por 5 min) e análise detalhada do "pellet" formado.
Nos casos de azoospermia torna-se necessária a coleta cirúrgica por punção ou biópsia.
Coleta de espermatozóides do epidídimo
Várias técnicas de coleta são indicadas em casos de azoospermia: aspiração microcirúrgica dos espermatozóides do epidídimo (MESA), aspiração percutânea dos espermatozóides do epidídimo (PESA), biópsia e extração dos espermatozóides do testículo (TESE), aspiração percutânea dos espermatozóides do testículo (TESA).
O método de escolha para a coleta dos espermatozóides depende de vários fatores (facilidades para criopreservação, características do caso, etc), especialmente da experiência do cirurgião com essas técnicas.
A MESA é uma técnica invasiva, em princípio indicada para os casos em que existe a possibilidade de uma correção microcirúrgica da azoospermia. Na impossibilidade da realização de uma vasoepididimostomia, a MESA poderá coletar amostra em suficiente quantidade para o processo de criopreservação.
Em geral, quando a azoospermia obstrutiva é causada por vasectomia (causa mais frequente) o tratamento de escolha é a reversão da vasectomia. O nível de sucesso da reversão é de 50%. Por outro lado, em casos de obstrução do epidídimo por infecções (Chlamydia trachomatis species ou Neisseria gonorrhea), o tratamento cirúrgico possui resultados que não excedem 20% de gestações. Nessa situação, a coleta dos espermatozóides do epidídimo com subsequente ICSI apresenta resultados satisfatórios. Em linhas gerais, não há diferença entre as taxas de fertilização dos óvulos e de gravidez após ICSI reali zado com espermatozóides criopreservados ou a fresco (Tournaye et al., 1999).
Nos homens nos quais a reconstrução cirúrgica não está indicada, a MESA poderá ser realizada com coleta de grande número de espermatozóides para criopreservação, entretanto opção menos invasiva como a PESA seria mais indicada, pois tal procedimento usa anestesia local e o paciente estaria dispensado logo após a coleta. Collins et al. (1996) acreditam que não há diferença na recuperação de espermatozóides por MESA ou PESA. Friedler et al. (1998) referem que o prognóstico após ICSI é semelhante nos casos de azoospermia obstrutiva com espermatozóides criopreservados colhidos com PESA ou MESA. Por outro lado, a PESA pode ser executada várias vezes no mesmo epidídimo, entretanto sua principal desvantagem é uma possível fibrose local. Os resultados com PESA seguido com ICSI são satisfatórios, variando fundamentalmente em função da idade das pacientes (Tabela I).
Tabela I. Resultados clínicos e laboratoriais da coleta de espermatozóides por PESA seguida de ICSI no Centro de Reprodução Humana da Fundação Maternidade Sinhá Junqueira - Ribeirão Preto - Brasil.
Coleta de espermatozóides do testículo
A biópsia testicular aberta (TESE) tem sido empregada há muitos anos como parte do diagnóstico diferencial da azoospermia. A observação de uma espermatogênese anormal levaria ao diagnóstico de uma azoospermia não obstrutiva. Por outro lado, a biópsia testicular é um método eficiente na coleta de espermatozóides para a ICSI. Habitualmente, o procedimento pode ser ambulatorial, empregando-se anestesia local. Entretanto, em algumas ocasiões o procedimento pode causar grande desconforto em pacientes mais sensíveis. As principais complicações agudas seriam o hematoma escrotal e a infecção, e a longo prazo, devese aval iar o aparecimento de an ticorpos antiespermatozóides, a fibrose e calcificações testiculares com posterior desvascularização testicular (Schlegel and Su, 1997). A TESA (punção com agulhas de 21 -gauge) é um procedimento mais indicado do que a biópsia testicular nos casos de espermatogênese normal. Em geral, as amostras colhidas por TESA contem uma quantidade de tecido testicular suficiente para o procedimento da ICSI e subsequente criopreservação dos espermatozóides excedentes. Tournaye et al. (1998) acreditam que em casos de espermatogênese normal não há diferença na coleta de espermatozóides executando-se TESE ou TESA. Aproximadamente 20% dos homens que procuram uma clínica de infertilidade apresentam azoospermia por falha da espermatogênese ou insuficiência testicular primária A histologia poderá mostrar parada de maturação, aplasia de células germinativas (síndrome de somente células de Sertoli) ou atrofia e esclerose tubular. Por outro lado, Levin (1979) mostrou que em alguns o padrão histológico pode não ser uniforme, ou seja, a parada da maturação ou a síndrome de Sertoli pode não atingir todos os túbulos, observando-se em algum deles a presença de espermatogênese focal. Tal fato, faz com que muitos especialista procurem retirar amostras testiculares em várias regiões nos casos de insuficiência testicular primária. Por outro lado, nenhum prognóstico pode ser determinado quanto as chances de coleta de gameta masculino para ICSI em casos de azoospermia não obstrutiva. Até mesmo, descreveram-se casos da S índrome de Klinefelter (47, XXY) com coleta de espermatozóides e nascimentos (Palermo et al., 1998). Atualmente, o uso de colagenase para dissolver o tecido testicular pode facilitar a identificação de espermatozóides na amostra. O uso de TESA nos casos de azoospermia não obstrutiva apresenta resultados discretos. Alguns autores indicam a biópsia com microscópio para que a dissecção identifique os túbulos com melhores características e consequentemente maiores chances de obtenção de espermatozóides. Por outro lado, nos pacientes azoospérmicos a biópsia testicular bilateral aumentou a detecção de espermatogênese focal em 68% dos casos quando comparada com a abordagem unilateral (Plas et al., 1999). A taxa de fertilização dos oócitos com espermatozóides obtidos do epidídimo costuma ser ligeiramente superior a obtida com espermatozóides do testículo (Watkins et al., 1997). Nossos dados (Tabela I e II) confirmam essa hipótese.
Tabela II. Resultados clínicos e laboratoriais da coleta de espermatozóides por TESE seguida de ICSI no Centro de Reprodução Humana da Fundação Maternidade Sinhá Junqueira - Ribeirão Preto - Brasil.
Coleta de espermatozóides em pacientes com distúrbios da ejaculação
A ausência da ejaculação pode ocorrer por diferentes razões, como lesões medu lares, disfunções psicosexuais, diabete mellitus e esclerose múltipla. A lesão traumática da medula resultante de acidentes de carro, quedas, atividades esportivas ou violentas é uma causa muito frequente. As lesões de medula atingem uma população masculina jovem (16-35 anos), levando na maioria dos casos a uma inabilidade de ejacular durante o ato sexual. A gravidez na parceira somente será obtida com a aplicação de métodos de ejaculação assistida. O uso de estímulo vibratório no pênis (EVP) associada ao ICSI pode solucionar esses casos, de uma forma não traumática. Em geral, pacientes com injúria recente (18 meses) não respondem rapidamente ao EVP. A alcalinização da urina está indicada pois o paciente pode ejacular urina junto com o esperma ou ter uma ejaculação retrógrada. A bexiga deve ser drenada, instila-se 25-50 mi de solução fisiológica, cerca de 10 minutos antes do EVP. O EVP pode causar por via reflexa: aumento da pressão arterial, sudorese, arrepios e dor de cabeça, geralmente pacientes com lesões de T6 ou acima. A aplicação pode ser executada cada 5 minutos, e observa-se as condições da pele da glande antes de reiniciar, habitualmente realiza-se um total de 15 minutos de EVP por sessão. Mesmo não se observando a ejaculação anterógrada, não se pode excluir a ocorrência de ejaculação retrógrada que é sempre acompanhada de respostas somáticas (aumento da pressão arterial e contração dos músculos periuretrais ou abdominais). Um fato é importante, a falta de qualquer resposta somática é preditiva de ausência de ejaculação. O índice de sucesso gira em torno de 50% (Brackett, 1999).
Edwards R. Goo - Maturation in vitro of human ovarian oocytes. Lancet 11, 926-929; 1965.