JBRA Assist. Reprod. 2000;04(03):120-123
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2000.4.3.04
Resumo
Relatar o desenvolvimento embrionário em cultura de longa duração em meio seqüencial. Avaliar taxa de implantação e gravidez. Cultura embrionáriaem meio de cultivo G1:21 G2:2, por cinco dias. A taxa de blastocistos expandidos encontrada em nosso estudo foi de 14%. As taxas de gravidez e implantação foram 28,9% e 14,9% respectivamente. Não obtivemos taxas de gravidez ou implantação maiores que as relatadas em literatura para os meios convencionais. Nas pacientes em que blastocistos expandidos foram transferidos as taxas de implantação e gravidez aumentaram. Não apenas as condições de cultura influenciam as taxas de implantação e gravidez, mas a qualidade dos óvulos também é importante, pois as "boas respondedoras" tiveram melhores resultados.
Palavras chave: cultura, meio seqüencial, blastocisto
Abstract
To relate the embryónic development in culture of long duration in sequencial medium, and evaluate the implantation rate and pregnancy. Embryonic culture with culture medium G I:2/G2:2, for tive days. The expanded blastocysts rate found in our study was 14%. The rate of pregnancy and implantation were 28,9% and 14,9% respectivelly. There was no rate of pregnancy or implantation increased than in the related literature to the convencional medium. In the patients wich expanded blastocysts were transfered the implantation rates and pregnancy increased. The culture conditions didn't just influence the implantation rates and pregnancy, but the quality of the ova is also important, because the good responders had better results.
Key words: culture, sequential medium, blastocyst
Introdução
A cultura de embriões humanos ainda não é satisfatória e considera-se este fato como o principal responsável pelas baixas taxas de implantação e gravidez. É difícil avaliar morfologicamente os efeitos deletérios que os meios de cultura exercem sobre os embriões. Na tentativa de avaliar a viabilidade dos embriões, muitos autores têm realizado a transferência para o útero no dia 5 pós-fertilização em estágiode blastocisto, sendo sugerido por alguns que isto só é válido nos casos onde têm-se grande número de embriões, enquanto outros apoiam a idéia de que a sincronização do embrião com o trato feminino é importante (Behr et al., 1999; Bolton et al., 1991). Uma outra vantagem da transferência tardia de embriões é quando existe a necessidade de diagnóstico pré-implantação, permitindo maior tempo para o diagnóstico genético (Gardner et al., 1998a). O principal problema com a transferência de blastocistos é conseguir condições de cultura hábeis em suportar o desenvolvimento dos embriões até o dia 5 ou 6 pós-fertilização.
Alguns autores renovaram as espéranças de melhores taxas de gravidez com o advento dos meios de cultura seqüenciais livres de soro, formulados para cultura do zigoto ao blastocisto. Estes meios foram formulados de acordo com estudos sobre a fisiologia e o metabolismo do embrião, que levaram à oportunidade do uso de meios mais próximos às necessidades dos embriões. As mudanças na composição do meio incluem modificações de carbohidratos e aminoácidos, além de outras. Estes meios levaram à taxas de formação de blastocisto superiores a 50% no dia 5 de desenvolvimento e taxas de gravidez e implantação superiores a 65 e 50% respectivamente (Gardner et al., 1998a,b).
Ainda existe muita controvérsia em relação às melhores condições de cultura. A proposta deste estudo é relatar nossa experiência com o uso de meio seqüencial G 1 .2/G2.2 e transferência embrionária no dia 5/6 pós-fertilização.
Materiais e Métodos
Pacientes
Este estudo envolveu 55 pacientes com idade entre 23 a 45 anos, durante o período de junho de 1999 a junho de 2000, que tiveram seus embriões cultivados em meio seqüencial. A inclusão das pacientes no estudo ocorreu após avaliação propedêutica de rotina e com consentimento prévio.
A estimulação ovariana era iniciada com acetato de leuprolide (Lupron; TAP Pharmaceutical, Abbot Laboratories, Chicago, U.S.A.); 0, 15 ml/dia, a partir do vigésimo primeiro ao vigésimo terceiro dia do ciclo menstrual até o início da menstruação seguinte. No terceiro dia de sangramento era iniciada a indução, com redução do Lupron para 0.05 ml/dia e a estimulação ovariana era realizada com gonadotrofina menopausai humana (Menogon; Ferring, São Paulo) 150-225UI/ dia. O crescimento folicular era monitorado somente por ultra-sonografia endovaginal. A gonadotrofina coriônica humana (hCG; 10.000 UI; Profasi; Serono-São Paulo) era administrada quando pelo menos 3 folículos com 20 mm de diâmetro foram observados. Os ovócitos foram aspirados 34-36 horas após a injeção de hCG através da punção ovariana transvaginal guiada pela ultra-sonografia (USG).
Fertilização in vitro
Os ovócitos colhidos foram lavados em D-PBS (GIBCO Laboratories, Grand Island, NY, U.S.A.), transferidos para placas contendo meio de cul tura Menezo B2 (Laboratorie CCD, Paris, França) e mantidos em incubadora (Forma modelo 3159) a 37°C, com atmosfera contendo 5% de CO2 e umidade de 97%. O sêmen era preparado através de gradiente descontínuo de Percoll (55 / 90%; Pharmacia, Uppsala, Sweden). Nos casos de infertilidade por fator masculino os ovócitos eram submetidos à injeção intracitoplasmática. Tal procedimento era realizado 3 a 6 horas após a coleta dos ovócitos, quando estes eram desnudados com o auxílio de hialuronidase (H- 3757, Sigma). Nos casos onde os parâmetros do sêmen eram adequados realizava-se a inseminação dos ovócitos com 100.000 espermatozóides/ml.
Quando era realizada a micromanipulação utilizava-se microscópio invertido Diaphot 300 (Nikon, Japan) com contraste de fase Hoffman, sob aumento de 400X. O microscópio era equ ipado com micromanipuladores hidráulicos MMO-204D e injetores IM6 (Narishige, Tokyo, Japan). O procedimento iniciava-se com a identificação, imobilização e aspiração de um único espermatozóide a partir de uma gota de HTF modificado (lrvine Scientific, Sta Ana, USA) contendo polivinilpirrolidona (Irvine Scientific, USA). Os ovócitos eram mantidos por uma pipeta de sustentação, enquanto o espermatozóide era injetado.
Cultivo dos embriões e transferência uterina
A confirmação da fecundação era verificada L5 a L8 horas após a fertilização e os embriões com 2 pronúcleos (PN) eram colocados G 1 .2/G2.2 com 5% de soro albumina humana (Irvine Scientific,USA). O congelamento dos embriões em pronúcleo era realizado segundo protocolo proposto por Check et al. (1996), não obedecendo um padrão, sendo realizado segundo o histórico de cada paciente.
Os embriões em pronúcleo eram então colocados em placas contendo 50 ul de meio G 1 .2 cobertas sob óleo mineral até o dia 3, quando eram transferidos para 50 ul de meio G2.2 com 5% de soro albumina humana, permanecendo até o dia 5. A transferência uterina somente era realizada no dia 5, quando pelo menos um dos embriões tivesse atingido o estágio de blastocisto (BE), caso contrário eram mantidos por mais um dia em meio de cultura. Quando não havia a presença de blastocisto, trocava-se o meio G2.2 e a tranferência era realizada no dia 6. Eram selecionados para a transferência apenas os embriões que não apresentassem sinal de bloqueio no desenvolvimento. Na presença de mais de 3 blastocistos para a transferência, o restante era congelado segundo protocolo proposto por Menezo et al. (1992).
A fase lútea era suplementada com progesterona na dose de 50 mg/IM/dia, metil-prednisolona 16mg/dia e 80 mg/dia de ácido acetil-salicílico. A gravidez era detinida pela presença de gestação tópica e a presença de batimento cardíaco fetal (bct) após a 13ª semana pós-transferência.
Resultados
Foram incluídas neste estudo 55 pacientes, obtendo-se destas 305 (82,2%) ovócitos em metáfase II (MII), que foram inseminados ou submetidos ao ICSI. Foram descartados 66 (17,8%) ovócitos, pois apresentavam alguma anormalidade morfológica ao microscópio óptico ou não estavam em MII. Obteve-se 214 embriões (70,2%) e apenas 7 roram congelados em 2 PN. Dos 207 embriões cultivados em G 1 .2/G2.2, 78 chegaram ao estágio de blastocisto (37,7%), sendo 29 destes blastocistos expandidos (14,0%). Foram transferidos L28 embriões, sendo estes transferidos apenas em 45 pacientes, L3 destas engravidaram (28,9%). Em 6 casos houve falha de coleta de ovócitos, em 2 casos falha de fertilização e em 2 casos os embriões pararam o desenvolvimento muito precocemente e não foram transferidos. Foram observados 19 sacos gestacionais com bcf positivo à USG, sendo a taxa de implantação de 14,8%.
Nas 2L pacientes que tiveram BE após cultivo em G L :2/G2:2, foi obtido um total de 2L4 ovócitos, com L8L (84,6%) em MII. A taxa de fertilização foi de 75, I % (136/181). Dos 132 embriões que permaneceram em cultivo, 29 desenvolveramse até o estágio de BE, sendo 25 destes transferidos e o restante congelado. A taxa de gravidez foi de 57, I %, pois 12 pacientes engravidaram. A taxa de implantação por BE transferido foi de 76,0%, com 19 sacos gestacionais e bcf positivo.
Discussão
Na tentativa de obter embriões com maior chance de implantação, muitos autores têm utilizado meios seqüênciais no cultivo destes. A idéia do meio seqüencial baseia-se na divisão do período pré-implantacional em 2 fases. A primeira corresponde ao estágio de clivagem do embrião, caracterizado por níveis baixos de biossíntese, baixa capacidade respiratória e limitada capacidade de utilizar glicose como fonte de energia, pois a função mitocondrial está diminuída. Este período corresponde ao desenvolvimento do embrião através dos estoques maternos, antes da ativação do genoma, e requer uma completa proteção contra radicais livres (através do EDTA), além de um decréscimo na concentração de glicose e fosfato (Ménézo et al., 1999). Já no período pós-compactação aumentam as taxas de biossíntese, assim como a capacidade respiratória e a habilidade para utilizar glicose. Durante a compactação ocorre a formação do primeiro epitélio de transporte do concepto, quando então o embrião é capaz de ativamente controlar o gradiente iônico e regular seu meio interno (Gardner et al., 1996). De acordo com as mudanças fisiológicas é importante cons iderar mudanças nas formulações dos meios.
A ocorrência do bloqueio de desenvolvimento em várias espécies comuns coincide com a transição do estágio do oviduto para o uterino. Embriões de hamster entram no útero com 4-8 células, correspondendo esta fase ao bloqueio de desenvolvimento in vitro. Embriões de coelho permanecem no oviduto até tornarem-se mórulas, a mesma etapa na qual o bloqueio de desenvolvimento pode ser induzido in vitro. O bloqueio de desenvolvimento também ocorre em mórula, em embriões de gato, o mesmo estágio no qual eles entram no útero (Bavister, 1995). Análises do fluido do oviduto e do útero através do ciclo hormonal revelam mudanças na concentração de carboidratos tanto dentro do ciclo como entre o oviduto e o útero. Gardner et al. (1997) verificaram que os níveis de glicose no oviduto são mais baixos quando o ovócito/ pré-embrião estão presentes (0,5mM), enquanto o piruvato está aumentado (0,32 mM) e no útero a glicose alcança um pico de 3,15 mM e o piruvato está bem diminuído (0, 1mM). Entretanto deve-se levar em consideração que o ovócito e o pré-embrião são circundados por células do "cumullus" que são muito ativas metabolicamente e consomem glicose liberando piruvato e lactato. Além disso é importante considerar que o embrião de 2 células possui um específico transportador para a glicose, indicando alguma função fisiológica para esta hexose, talvez outras que não como fonte de energia. O desvio da utilização da glicose para outras vias pode levar à biossíntese de importantes anabólitos para o embrião, e o caminho metabólico e nutrientes preferidos podem levar a vantagens no suporte do desenvolvimento do embrião in-vitro. Importantes reguladores do metabolismo energético são os aminoácidos. Os aminoácidos essenciais não parecem conferir nenhum benefício ao embrião até o estágio de 8 células e até podem resultar em perda de viabilidade. Os aminoácidos essenciais estimulam a formação de ICM e os aminoácidos não essenciais de glutamina e a formação da blastocele. Todos estes dados demonstrados a respeito do metabolismo do embrião, justificam a grande utilização dos meios seqüenciais.
As taxas de gravidez clínica em fertilização in vitro com o uso dos meios convencionais giram em torno de 20 a 30% e as taxas de implantação são ainda menores, não muito diferentes do que as que obtivemos em nosso estudo com o uso de meio seqüencial, taxas de 28,9 e 14,8% de gravidez e implantação, respectivamente. Schoolcraft et al. (1999) têm recentemente mostrado taxas de gravidez e implantação, com o USQ de meio G 1 .2/G2.2 superiores a 60% e 40%, mas há diferenças importantes entre o estudo de Schoolcraft et al. (1999) e o nosso. A primeira é que nós usamos, 0G1 :2/G2:2 "comercial" no cultivo dos embriões, meio este que passou por transporte e provavelmente oscilações de temperatura que podem alterar a composição, e causar danos aos embriões. Outra diferença relevante é que a média do número de zigotos/ paciente foi menor e menos constante (3,9 ± 3,3) em nosso estudo. A média de ovócitos colhidos no estudo de Schoolcraft et al. (1999) foi de 21 ,4 ± 0,6 e conseqüentemente a média de embriões obtidos também foi maior (12,9 ± 0,5). Isto ocorreu devido a diferenças no critério de inclusão e seleção de pacientes. Apenas as pacientes "boas respondedoras", com pelo menos 10 folículos = 12 mm de diâmetro no dia dai njeção do hCG foram incluídas no estudo de Schoolcraft et al., 1999. Em seu estudo Schoolcraft et al., 1999 utilizaram 2 protocolos de estimulação diferentes e verificaram que há uma diferença significativa nas taxas de gravidez e implantação de acordo com o protocolo usado. Nossos resultados mostraram que quando blastocistos expandidos são transferidos as taxas de gravidez e implantação aumentaram de 57, 1 para 76% respectivamente. Deve-se observar no entanto que quando as pacientes tiveram blastocistos, tiveram também um número maior de ovócitos colhidos, e portanto de embriões em PN. Se considerarmos apenas as pacientes onde obteve-se mais que 7 ovócitos em metáfase II (MII), observamos que 65% das pacientes tiveram blastocistos expandidos, e apenas 39% tiveram este êxito quando consideramos todas as pacientes. pode-se verificar então que quando incluímos pacientes "boas respondedoras" nossa taxa de gravidez e implantação sofreu um incremento significativo.
Apesar dos grandes avanços na reprodução humana nos últimos anos, as taxas de gravidez ainda são insatisfatórias e maiores estudos ainda serão necessários para elucidar melhor os aspectos fisiológicos e metabólicos dos embriões. Talvez dividir as exigências metabólicas do embrião apenas em 2 fases, pré e pós-compactação, seja insuficiente e devem existir outros fatores metabólicos importantes ao desenvolvimento do embrião, ainda desconhecidos. Muitos autores têm optado pela transferência no dia 3, quando se têm até 4 embriões, e quando estes não apresentam fragmentação têm observado melhores taxas de gravidez do que quando embriões fragmentados são transferidos (Almodin et al., 1999). Um ponto parece de consenso entre os autores, que é, a necessidade da transferência de embriões morfologicamente saudáveis independentemente do estágio em que for feita a transferência.