JBRA Assist. Reprod. 2001;05(01):14-18
ARTIGO ORIGINAL
doi:10.5935/1518-0557.2001.5.1.03
Desenvolvimento de embriões bovinos cultivados em meio semidefinido suplementado com 1,5 mM de glicose
Development of bovine embryos cultured in semi-defined media supplemented with 1,5 mM glucose
1Médica Veterinária. Mestranda pelo Programa de Pós Graduação em Biologia Celular e Molecular da UFRGS
2Médico Veterinário. Doutorando pelo Programa de Pós Graduação em Biologia Celular e Molecular da UFRGS
3Médico Veterinário. Prof. Adjunto do Departamento de Ciências Morfológicas do Instituto de Ciências Básicas da Saúde da UFRGS
4Médico. Prof. Adjunto do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina -Setor de Reprodução Assistida - Hospital de Clínicas de Porto Alegre - Universidade Federal do Rio Grande do Sul
5Médico Veterinário. Pesquisador CNPq. Prof. Titular do Departamento de Patologia Climca da Faculdade de Veterinária da UFRGS
Resumo
O objetivo deste trabalho foi determinar se a adição de 1,5 mM de glicose em etapas iniciais do cultivo "in vitro" (24, 48 e 72 horas após a FIV) altera a taxa de desenvolvimento embrionário até o estádio de blastocisto em meio SOF modificado. Os oócitos foram obtidos a partir de ovários, de vacas de abatedouro, e maturados "in vitro" (MIV) durante 24 horas em TCM 199 acrescido de 10% de SVE e estradiol, FSH e HCG. A fecundação (FIV) foi realizada durante 18 a 20 horas em meio Fert-TALP acrescido de heparina, hipotaurina e epinefrina contendo 1 x 10" espermatozóides/mL, que foram obtidos a partir de palhetas de sêmen congelado e separados em gradiente descontínuo de percoll. Tanto a MIV quanto a FIV foram realizadas em estufa de cultivo a 39°C, 100% de umidade relativa e 5% de CO2 em ar. Para o cultivo embrionário foi utilizado o meio SOF com 0,4% de BSA, em gotas de 80 mL sob óleo mineral contendo 17 a 21 embriões por gota, em atmosfera contendo 5% CO2, 7% 02 em N2, 100% de umidade relativa do ar e 39°C. No primeiro experimento foi adicionado glicose 20 horas após a FIV, no início do cultivo (D1) e 48 horas após a FIV (D2). As taxas de clivagem foram 67,8% (97/ 143) no grupo D1 e 69,9% (11 6/166) no grupo D2. Nos grupos D1 e D2, respectivamente, as taxas de blastocisto D7 (12,6% e 16,3%), D8 (8,4% e 7,2%), D9 (4,2% e 1,2%) e total de blastocistos (25,2% e 24,7%) não diferiram signiticati vamente (p>0,05). No segundo experimento foi adicionado glicose 20 horas após a FIV, no início do CIV (D1) e 72 horas após a FIV (D3). Foi observado 63,5% de clivagem (115/181) no grupo D1, e 69,0% (129/ 187) no grupo D3. As taxas de blastocistos foram 25,4% (46/181) para o grupo D1 e 23,0% (43/187) para o grupo D3. Neste experimento também não houve diferença significativa entre os tratamentos (pp>0,05). Nas condições do experimento, o momento da adição da glicose (D1, D2 ou D3) não alterou as taxas de desenvolvimento embrionário.
Unitermos: cultivo embriões bovinos, SOF, glicose, desenvolvimento blastocisto.
Abstract
The purpose of these experiments was to test the appropriateness ofmodified SOF, supplemented with glucose to support bovine in vitro derived embryos to develop and reach the blastocyst stage. Ovaries were collected from cows after slaughter and storage at 28°C in NaCI 0.9% solution for transport to the laboratory. The ovaries surface were sliced in PBS medium and the cumulus oocytes complexes (COCs) were isolated and evaluated using a stereomicroscope (45x) equipped with a heating table (38°C). Only COCs classified morphologically as excellent were in vitro matured. For in vitro maturation, the COCs were cultured TCM 199 supplemented with 0.5 μg/mL FSH, 0.03 IU/mL hCG, 1 μg/mL β-estradiol and 10% estrous cow serum (ECS). An average 20 COCs were placed in 100 μL drops covered with mineral oil and were cultured for 24 hours at 39°C and 5% CO2 in air. Frozen-thawed spermatozoa were separated by discontinuous Percoll gradient in Sperm-TALP for in vitro fertilization. Capacitation was induced by incubating the spermatozoa in Fert-TALP supplemented with 5,76 μg/mL heparin, 1,1 μg/mL hypotaurine, 0, 183 μg/mL epinephrine, 3 mg/rnL penicillamine for 30 minutes at 39°C and 5% CO2 in air. A total of 106 spermatozoa /rnL were added to 100 μL droplets of Fert-TALP covered with mineral oil and containing 20 COCs. After 18 hours of culture the oocyteslzygotes were pooled and randomly divided into the experimental groups. The 1 .5 mM glucose was added to the modified SOF medium in three differents moments: Group I: 20 hours after FIV; Group 2: 48 hours after FIV and Group 3: 72 hours after FIY. The culture was performed by exposing the embryos to 5% CO2, 7% O2 and 88% N2, at 39°C in one incubator chamber. Experiments were repeated 3 or 4 times for each treatment. The cleavage rates in the first experiment were 67.8% (97/143) in the group 1 and 69.9% (116/166) in the group 2. In the groups 112.6% (18/143) achieved the blastoyst stage on Day 7, 8.4% (12/143) on Day 8 and 4.2% (6/143) on Day 9. The embryo development observed in the group 2 were 16.3 % (27/166) on Day 7, 7.2% on Day 8 (12/166) and 1 .2% on Day 9 (2/166). The total number ofblastocysts was 25.2% (36/ 143) in the group 1, and 24.7% (41/166) in the group 2, did not differ significantly (p>0,05). In the second experiment was observed the following blastocyst development rates: Group I, 63 .5% (115/181) and Group 369.0% (129/ 187) of cleavage. The blastocyst rates were 25.4% (46/181) for the Group 1 and 23.0% (43/187) for the Group 3. In the Group 112.1 % (22/181) achieved the blastocyst stage on Day 7, 7.7 % (14/181) on Day 8 and 5.5% (10/181) on Day 9. The embryo development observed in the Group 3 were 9.1 % (17/187) on Day 7, 9.6 % (18/187) on Day 8 and 3.2% (6/187) on Day 9. In conclusion, the present results showed that the glucose supplementation has not change the embryo capacity to develop until the blastocyst stage cultured in modified SOF medium.
Key words: embryo bovine culture, SOF, glucose, blastocyst development
Introdução
A glicose é um importante substrato para as células. Ela e seus metabólitos são utilizados principalmente na produção de energia, síntese de triglicerídeos, glicoproteínas, aminoácidos e nucleotídeos. Após entrar na célula, geralmente auxiliada por uma proteína transportadora específica, a glicose é rapidamente fosforilada pela hexocinase e transformada em glicose-6-fosfato, que dificilmente sai da célula. A glicose pode ser utilizada por três vias principais: 1) a transformação em glicose- I - fos fato e subseqüente armazenamento na forma de glicogênio, que ocorre quando ATP e glicose-6-fosfato estão disponíveis em grande quantidade; 2) transformação em frutose-6-fosfato, que pode ser utilizada junto com a glutamina para a transaminação e produção de N-acetilglicosamina, ou seguir na via glicolítica com produção de piruvato, que ocorre quando a célula necessita de ATP ou esqueletos carbonados para biossínteses (triglicerídeos, aminoácidos, glicoproteínas); e 3) utilização pe la via pentose fosfato que fornece frutose-5-fosfato, essencial para a síntese de nucleotídeos e NADPH para biossínteses redutivas.
Após a ativação do genoma embrionário o consumo e o metabolismo da glicose aumentam significativamente e parece ser obrigatório para o subseqüente desenvolvimento (Rieger, 1993). O autor considera como principais utilizações da glicose, nestes estádios, a síntese de glicoproteínas e o fornecimento energético para a formação e expansão da blastocele.
Porém, o exato mecanismo pelo qual o embrião passa a realizar glicólise a partir de um determinado momento do desenvolvimento embrionário ainda não está completamente elucidado. Alguns autores, como Telford (1990), correlacionam o aumento da utilização da glicose com a síntese de uma ou mais enzimas-chave da via glicolítica e atribuem o aumento acentuado do metabolismo da glicose à ativação do genoma embrionário.
Javed and Wright (1991) determinaram a atividade da via glicolítica (Embdey-Meyerof-Pathway - EMP) e da via pentose fosfato (PPP) em diferentes estádios de desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vivo e concluíram que a utilização absoluta da glicose aumenta significativamente a partir de mórula e que a atividade relativa da via EMP/PPP aumenta com o desenvolvimento embrionário. Entretanto, Rieger et al. (1992) determinaram o consumo de glicose em embriões bovinos produzidos in vitro em diferentes estádios embrionários e observaram um aumento significativo do consumo de glicose entre 8- e 16-células e entre mórula e blastocisto. Para estes autores, este primeiro aumento significativo da utilização da glicose pode estar associado à síntese de uma ou mais enzimas-chave da via glicolítica, que coincide com a ativação do genoma embrionário, ou à regulação alostérica das atividades enzimáticas. Sugerem que este aumento do consumo de glicose próximo ao momento da cavitação pode estar associado com o aumento da atividade da bomba Na-K-ATPase.
Outro ponto chave é que diferente sistemas de cultivo promovem a utilização diferenciada de glicose. Isto foi investigado por Krisher et al. (1999) que compararam a atividade glicolítica de mórulas e blastocistos produzidos in vitro, na ausência e na presença de BSA. Notaram que a glicólise foi maior nos embriões produzidos na presença de BSA. Da mesma forma Khurana & Niemann (2000) observaram que os embriões produzidos in vitro são mais precoces na utilização de glicose do que os produzidos in vivo.
Outros autores correlacionam diferenças no desenvolvimento embrionário com as concentrações de fontes energéticas utilizadas no sistema de cultivo. Sugerem que concentrações 5,56 mM de glicose no início do cultivo in vitro são prejudiciais ao desenvolvimento embrionário (Takahashi & First, 1992 e Kim et al., 1993). Iwata et al. (1998) também observaram efeito tóxico da glicose, determinado pela produção de blastocistos, cultivados na concentração de 4,5 mM em embriões bovinos produzidos in vitro cultivados em SOF suplementado com soro, quando comparado à concentração de 1,5 mM.
Uma vez que a adição de altas concentrações de glicose no início do desenvolvimento embrionário promove efeito tóxico e que a glicose é uma importante fonte energética em etapas subseqüentes do cultivo, este trabalho teve como objetivo determinar se a adição de 1,5 mM de glicose em etapas iniciais do cultivo in vitro (24, 48 e 72 horas após a FIV) altera as taxas de desenvolvimento embrionário in vitro até o estádio de blastocisto.
Material e método
Maturação in vitro
Os ovários foram colhidos imediatamente após o abate das vacas e transportado até o laboratório em recipiente térmico, à 35°C, contendo solução fisiológica acrescida de penicilina e estreptomicina. Os complexos Cumulus-oócito (CCOs) foram obtidos por escarificação da córtex ovariana em solução de PBS modificado suplementada com 1 % de soro fetal bovino (Nutricell) e 1700 UI de heparina (Sigma, H-0777). O meio contendo os oócitos era tamisado para um copo de Becker e após 20 minutos o sobrenadante era retirado por sifonagem. O sedimentado contendo os oócitos era transferido para placas de Petri de 90 mm (Pleion, C-10) onde era realizada a procura, sob estereomicroscópio (15x). Os CCOs eram transferidos para placas de Petri de 35 mm (Greiner, 627160) contendo TCM modificado composto por TCM 199 (Sigma, M-2520) acrescido de 4,2 mM de NaHC03 (Sigma, S-5761), 50 μg/mL gentamicina (Sigma, G- 1264), 1 mg/mL de BSA, 14,3 mM Hepes (Sigma, H- 3375), onde eram selecionados. Os CCOs que apresentavam Cumulus oophorus compacto e citoplasma homogêneo eram maturados em estufa de cultivo a 39°C, com 100% de umidade relativa do ar, durante 24 horas, em grupos de 20 por gota de 100 μL, em placas de 35 mm, sob óleo mineral (Sigma, M-8410), em meio TCM 199 acrescido de 50 μg/mL de gentamicina, 0,2 mM piruvato de sódio (Merck, 6619), 26 mM NaHCO3, 0,5 μg/mL FSH (Vetpharm, Folltropin-V), 0,03 UI/mL hCG (Organon, Pregnil), μg/mL estradiol (Sigma, E-8875) e 10 % de soro inativado de vaca em estro.
Fecundação in vitro
Para a fecundação foram utilizadas palhetas de 0,5 mL de sêmen congelado de um único touro. Os espermatozóides eram separados em gradiente descontínuo de Percoll (45%/90%) por centrifugação a 500 x g durante 20 min. O centrifugado contendo os espermatozóides móveis era lavado com 5 mL de Sperm-TALP composto por 100 mM NaCI (Sigma, S-5886), 3,1 mM KCI (Sigma, P-5405), 2,9 mM NaH2P04 (Sigma, S-5011), 2,0 mM CaCI2 (Sigma, C-7902), 0,4 mM MgCI2 (Sigma, M-2393), 50 mg/mL gentamicina (Sigma, G- 1264), 16,9 mM lactato de sódio (L-4263), 10 mM Hepes (Sigma, H-3375), 25 mM NaHCO3 (Sigma, S-5761), 10 μg/mL vermelho de fenol (Sigma, P-5530), 1 mM piruvato de sódio (Merck, 6619), 6 mg/mL BSA (Gibco, 110 18-017) e novamente centrifugado (500 x g /10 min). Os espermatozóides eram ressupensos no meio de fecundação (Fert-TALP) composto por 113,9 mM NaCI (Sigma, S-5886), 3,2 mM KCI (Sigma, P-5405), 2,9 mM NaH2P04 (Sigma, S-5011), 2,0 mM CaCl2 (Sigma, C-7902), 0,78 mM MgCI2 (Sigma, M-2393), 50 mg/mL gentarnicina (Sigma, G- 1264), 7,6 mM lactato de sódio (L-4263), 25 mM NaHCO3 (Sigma, S-5761), 10 μg/mL vermelho de fenol (Sigma, P-5530), 0,25 mM piruvato de sódio (Merck, 6619), 6 mg/mL BSA (Gibco, 110 18-017) suplementado com 3 mg/mL penicilamina (P-5125), 5,76 μg/mL de heparina (Sigma, H-3149), 1,1 μg/mL hipotaurina (Sigma, H- 1384), 0, 183 μg/mL epinefrina (Sigma, E-4250) em volume suficiente para que a concentração final fosse de aproximadamente 50.000/ μL. Os oócitos eram lavados três vezes neste meio e transferidos para gotas de fecundação (20 CCOs/gota de 100 μL), em placas de 35 mm, sob óleo mineral, onde eram inseminados com 100.00 espermatozóides (l,7 a 2,3 μL). Após permaneciam durante 18 a 20 horas a 39°C, em atmosfera de 5% de CO2 em ar e 100 % de umidade relativa.
Cultivo in vitro
Os zigotos eram transferidos para um tubo cônico de 15 mL (Costar, 3218) contendo 500 μL de TCM modificado e agitado em "vortex" a 1800 rpm durante 2 min para a remoção das células do Cumulus oophorus. Após eram lavados três vezes no meio de cultivo e transferidos para o cultivo em meio SOFaaBSA descrito por Gardner et al. (1994) modificado, contendo 107,7 mM NaCI (Sigma, S-5886), 7,2 mM KCI (Sigma, P-5405), 1,2 mM KH2P04 (Sigma, P-5655), 1,7 mM CaCI2 (Sigma, C-7902), 0,48 mM MgCl2 (Sigma, M-2393), 1,5 mM lactato de sódio (L-4263), 25 mM NaHCO3 (Sigma, S-5761), 10 μg/mL Vermelho de fenol (Sigma, P-5530), 50 mg/mL gentamicina (Sigma, G- 1264), 0,32 mM Piruvato de sódio (Merck, 6619), 1. mM glutamina (Sigma, G-5763), 4 mg/mL BSA (Gibco, 11018-017), 2% v/v solução de aminoácidos essenciais (Sigma, B- 6766), 1 % v/v solução de aminoácidos não essenciais (Sigma, M-7145). No primeiro experimento, os embriões foram cultivados desde o início em gotas de 80 mL deste meio contendo 1,5 mM de glicose (D1) ou em gotas de 70 mL deste meio sem Glicose adicionando-se 10 mL do mesmo meio contendo 12 mM de Glicose 48 horas após a FIV (D2). No segundo experimento, os embriões foram cultivados de forma semelhante ao primeiro, porém a adição de glicose se deu 72 horas após a FIV (D3). A concentração final de glicose em todos os grupos era de 1,5 mM e eram cultivados 17 a 20 embriões por gota, em placa de cultivo com poços (Greiner, 627170), sob óleo mineral, a 39°C, com 100% de umidade relativa, 5% de CO2, 7% de O2 em N2.
Desenvolvimento in vitro
A taxa de clivagem era observada 24 horas após o início do cultivo e as taxas de blastocisto eram observadas nos 7º, 8º e 9º dia de cultivo, considerando o momento da FIV como Dia 0.
Análise estatística
Os resultados obtidos foram analisados pelo teste de Quiquadrado, com nível de significância de 5%.
Resultado
Os resultados do experimento 1 estão apresentados nas tabelas I e II. Não foi observada diferença significativa (p>0,05) nas taxas de clivagem e de desenvolvimento até blastocisto com . adição de glicose 20 ou 48 horas após a FIV(Tabela I). Quando foi analisada a velocidade de formação destes blastocistos, dias 7, 8 e 9, também não foi observada diferença significativa entre os tratamentos (Tabela II).
TABELA I. Taxas de desenvolvimento embrionário no cultivo in vitro após a adição de glicose 20 horas após a FIV (D1) e 48 horas após a FIV (D2).
TABELA II. Desenvolvimento embrionário no cultivo in vitro até blastocisto após a adição de glicose 20 horas após a FIV (D 1) e 48 horas após a FIV (D2).
No segundo experimento não foi observada diferença para as taxas de clivagem e de blastocistos significativa entre os tratamentos (p>0,05), conforme apresentado nas Tabelas III e IV.
TABELA III. Taxas de desenvolvimento embrionário no cultivo in vitro após a adição de glicose 20 horas após a FIV (D 1) e 72 horas após a FIV (D3).
TABELA IV. Desenvolvimento embrionário no cultivo in vitro até blastocisto após a adição de glicose 20 horas após a FIV (D1) e 72 horas após a FIV (D3).
Discussão
Os resultados dos experimentos indicam que a adição de 1,5 mM de glicose nas etapas iniciais do cultivo in vitro não interferiram nas taxas de desenvolvimento embrionário (Tabelas I a IV).
Conforme trabalhos realizados por Javed & Wright (1991) e Rieger et al. (1992), há indícios de que os embriões bovinos utilizam glicose em maior quantidade a partir de mórula, mas que já estariam aptos a realizar glicólise entre 8- e 16-células. Khurana and Nieman, (2000) determinaram o consumo de glicose e sua via de utilização em embriões bovinos produzidos in vitro e in vivo em diferentes estádios embrionários. Observaram que o primeiro aumento significativo da oxidação da glicose a CO2 ocorre entre 12- e 16-células. Relataram que a glicólise anaeróbica, com produção de lactato, inicia a partir de 12-células in vitro, enquanto que in vivo apenas a partir de 16-células, e que ocorre um aumento gradual até o estádio de blastocisto. Além de serem mais precoces na produção de lactato, os embriões produzidos in vitro também o produzem em maior quantidade. Os autores relataram também que a utilização de glicose ocorre mesmo com fontes alternativas de energia como o lactato e o piruvato e que o perfil desta utilização permanece similar; entretanto, o consumo absoluto de glicose é reduzido entre 60 e 70%. Neste estudo, os autores também descreveram que, independente do sistema de produção (in vitro ou in vivo), até o estádio de 16-células, a oxidação do piruvato ocorre preferencialmente em relação à utilização do lactato ou glicose. Observaram que 70 a 90% da glicose é metabolizada pela glicólise anaeróbica (produção de lactato) e sugerem que, em função da atividade do ciclo de Krebs, a adição de piruvato e lactato reduz em mais de 50% a utilização de glicose. Uma importante observação deste mesmo trabalho foi que oócitos maturados in vitro fizeram glicólise anaeróbica com produção de lactato. Os autores sugerem que os embriões bovinos possuem desde o início de seu desenvolvimento toda a maquinária enzimática da via glicolítica, porém, esta está inibida por regulações intracelulares até o estádio de 12- células, quando a taxa de crescimento e demanda energética aumenta significativamente no embrião. Nossos resultados corroboram estas evidências, tendo em vista que a privação de glicose até 48 e 72 horas após a FIV não alterou as taxas de desenvolvimento embrionário até blastocisto (Tabelas I e III). Além disto, diferentes sistemas de cultivo promovem a utilização da glicose a partir de estádios diferentes do desenvolvimento. Isto foi observado por Krisher et al. (1999) que compararam a atividade do ciclo de Krebs e atividade glicolítica de mórulas e blastocistos produzidos in vitro, na ausência e na presença de BSA. Notaram que a atividade do ciclo de Krebs não foi diferente nos embriões produzidos nos diferentes sistemas, porém a glicólise foi maior nos embriões produzidos na presença de BSA, mostrando que o metabolismo embrionário é modificado pelos diferentes sistemas de cultivo.
Concentrações elevadas de glicose (5,56 mM), na ausência de co-cultivo celular, no início do desenvolvimento embrionário in vitro promovem efeito tóxico conforme Takahashi & First (1992), Kim et al. (1993) e Iwata et al. (1998). Entretanto, não está claro como a glicose inibe o desenvolvimento embrionário. Esta inibição pode estar associada à produção de radicais livres pelo seu metabolismo oxidativo ou também pode ser explicada pelo efeito "Crabtree" (Seshagiri & B avister, 1991). Este efeito foi observado em várias espécies em que elevadas concentrações de glicose, na presença de fosfato inorgânico, inibe o desenvolvimento embrionário. O fosfato estimula a glicólise através da ativação de três enzimas chave da via glicolítica (hexocinase, fosfofrutocinase e gliceraldeido-3- fosfato-desidrogenase) e diminui a inibição da hexocinase pela glicose-6-fosfato. A ativação da glicose resulta na inibição da respiração mitocondrial.
Este efeito prejudicial ao desenvolvimento embrionário não foi observado neste trabalho com a concentração de 1,5 mM. Da mesma forma, Takahashi & First (1992) obtiveram resultados semelhantes sobre o desenvolvimento in vitro até mórula. Utilizaram diferentes concentrações de glicose durante o cultivo de embriões bovinos produzidos in vitro em meio SOF, suplementado com BSA, contendo lactato e piruvato. Observaram que a concentração de 5,56 mM foi prejudicial ao desenvolvimento embrionário até o estádio de mórula quando comparada às concentrações 0,56 mM e 1,5 mM. Segundo estes autores o lactato (3,3 mM) é capaz de sustentar o desenvolvimento embrionário até mórula na ausência de piruvato e de glicose, com taxas semelhantes àquelas obtidas com lactato e piruvato, glicose e lactato, glicose e piruvato, ou glicose, lactato e piruvato. Além disto, relataram que a adição de 5,56 mM de glicose no estádio de mórula não interferiu no desenvolvimento até blastocisto. Iwata et al. (1998) obtiveram resultados semelhantes quando utilizaram 5% de O2, entretanto, esta mesma concentração de glicose (1,5 mM) na presença de 20% de O2 foi prej udicial ao desenvolvimento embrionário. Estes dados sugerem que o efeito tóxico esteja relacionado ao metabolismo oxidativo. Kim et al. (1993) cultivaram embriões bovinos produzidos in vitro, desde zigoto, em meio quimicamentedefinidocontendo 10 mM lactato e 0,5 mM de piruvato, na ausência e na presença de 5,56 mM de glicose, e observam que na presença desta concentração de glicose não houve interferência sobre a taxa de clivagem (2-células), porém houve diminuição na taxa dos embriões que se desenvolveram até 8-células e mórula, não havendo desenvolvimento até blastocisto. Quando utilizaram o mesmo meio mas enriquecido com aminoácidos e suplementado 120 horas após a inseminação com diferentes concentrações de glicose (O; 0,7 ; 2,8; 5,6 e 11,1 mM) obtiveram resultados semelhantes sobre o desenvolvimento até mórula em todas as concentrações. Porém as concentrações entre 1,4 e 5,6 mM proporcionaram melhores taxas de desenvolvimento até blastocisto expandido.
Os resultados observados neste trabalho indicam que a adição de 1,5 mM de glicose em etapas iniciais do cultivo in vitro, no sistema utilizado, não alterou as taxas de desenvolvimento embrionário até blastocisto.