JBRA Assist. Reprod. 2001;05(01):30-34
ATUALIZAÇÃO
doi:10.5935/1518-0557.2001.5.1.07
Entendendo o processo de fertilização ... (da capacitação espermática até a fusão entre as membranas plasmáticas) Parte I
Understanding the fertilization process ... Part 1
Resumo
A reprodução humana requer a fusão do espermatozóide com o oócito em metáfase 11, durante a fertilização. Durante esta fase, é necessária a ocorrência de complexos eventos moleculares, genéticos, enzimáticos e mecânicos em ambos os gametas, a fim de que um adequado desenvolvimento embrionário e posteriormente, fetal possa propiciar o nascimento de um bebê saudável. Esta primeira parte da revisão teve por objetivo, detalhar as fases iniciais do processo de fertilização in vivo, desde a capacitação até a fusão entre a membrana plasmática do espermatozóide e o oolema.
Abstract
The human reproduction needs to spermatozoa and metaphase 11 oocyte fusion, during fertilization. During this, molecular, genetic, enzymatic and mechanical complex processes must be occur, leading embryonic and after, fetal development allowing health baby home. This first part ofreview focussed initials steps in in vivo fertilization process, beginning with capacitation until plasma membrane fusion.
Introdução
Antes de 1950, muito o que se sabia sobre fertilização estava relacionado aos invertebrados (ouriço do mar) e a alguns dos vertebrados não mamíferos (peixes e anfíbios), tendo em vista a grande quantidade de gametas disponíveis para estudo. O rápido progresso nas investigações, principalmente após o nascimento do primeiro bebê cuja fertilização ocorreu fora do organismo materno (Steptoe & Edwards, 1978) tem permitido uma melhor compreensão deste processo, em humanos. Com o surgimento da injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) - (Palermo et al., 1992), as taxas de falhas no processo de fertilização foram drasticamente diminuídas, quando comparadas à fertilização in vitro convencional (FIV). Pela ICSI, várias etapas da fertilização são ultrapassadas pela introdução do espermatozóide diretamente no ooplasma. Após sua entrada facilitada, o gameta masculino tem ainda que desempenhar algumas funções cruciais para um bom desenvolvimento embrionário. Diante das descobertas de eventos moleculares altamente complexos, sentimos a necessidade de estudar a fundo o processo de fertilização "in vivo" a fim de melhor compreender as falhas de fertilização e a ocorrência de fertilização anormal em reprodução humana assistida.
Definição
O processo de fertilização envolve a união de um oócito em metáfase II e um espermatozóide. Após ser liberado, o oócito secundário é levado para o infundíbulo da tuba uterina com o auxílio de movimentos peristálticos e de varredura das fímbrias. Espermatozóides produzidos nos túbulos seminíferos são então ejaculados no interior do sistema reprodutor feminino e começam a intensa trajetória até chegarem na presença do oócito. Milhares de espermatozóides passam pelo canal cervical e cerca de 200 apenas chegarão na ampola, por quirniotaxia.
Define-se fertilização como sendo um processo que culmina com a união de um e, apenas um, núcleo de espermatozóide com o núcleo do oócito, dentro de um ooplasma ativado. Através de uma sequência complexa de eventos moleculares extremamente coordenados, começa com o contato do espermatozóide com o oócito secundário e termina com o embaralhamento do material cromossôrnico e ativação do zigoto (Acosta, 1994). Tem como consequência o restabelecimento do número diplóide da espécie e a ativação do desenvolvimento embrionário. A entrada do' espermatozóide no oócito serve como gatilho para uma sequência de eventos metabólicos e para a ocorrência de alterações morfológicas. Além disso, a fertilização estimula o oócito secundário a completar a segunda divisão meiótica e liberar o corpúsculo polar. Permite variabilidade genética e é o momento de determinação do sexo do embrião.
Eventos que precedem o processo de fertilização
Desde o momento de sua formação nos túbulos seminíferos até a chegada na presença do oócito secundário, o espermatozóide humano sofre grandes modificações. Após ser liberado para a luz dos túbulos seminíferos, chega até o epidídimo onde ainda se encontra incapaz de fertilizar o oócito. No decorrer do seu trajeto, vão gradativamente adquirindo esta capacidade que culmina na presença do gameta feminino. A "fertil idade" do espermatozóide normalmente se refere a habilidade que o espermatozóide adquire para fertilizar oócitos fisiologicamente e estruturalmente normais in vivo e in vitro. Chamado de capacitação, este fenômeno começa no epidídimo e culmina com a aproximação do espermatozóide ao oócito, com aquisição da habilidade de iniciar a reação acrossômica (Allen & Green, 1997). Durante esta fase o gameta masculino utiliza fontes de energia limitada - representadas pelas mitocôndrias da peça intermediária - e se locomove por quimiotaxia em busca do gameta feminino.
Durante a maturação epididimária, uma das consequências mais proeminentes é a aquisição da motilidade. Acredita-se que, neste local, ocorra a transferência de muitas substâncias (Acott et al., 1981; Acott et al., 1983; Infante & Huszagh, 1985) do fluido epididimário para os espermatozóides. Outros episódios importantes referem-se à alterações na modulação do sistema da proteína kinase versus AMP cíclico e o desenvolvimento de um mecanismo para a manutenção de níveis baixos do cálcio intracelular. Alterações bioquímicas e estruturais da membrana plasmática dos espermatozóides também ocorrem durante esta fase.
Uma vez depositadas na região anterior da vagina durante a relação sexual, uma vasta maioria das células é eliminada mais cedo ou mais tarde e uma pequena fração dessas células migra com sucesso e chega ao sítio da fertilização. Na presença do oócito, outras alterações metabólicas ocorrem no espermatozóide, propiciando o início do processo. As funções de reconhecimento do oócito (espécie-específico) e a liberação de enzimas hidrolíticas são atribuídas aos espermatozóides.
As fases da fertilização:
Fase 1 - Contato e reconhecimento entre e oócito
Frente ao oócito o espermatozóide modifica seu comportamento e passa por um processo denominado hiperativação (Yanagimachj, 1981). Basicamente caracterizado por uma alteração na motilidade, o gameta masculino exibe movimentos não progressivos mesclados com breves movimentos lineares a hiperativação do espermatozóide tem tempo e local determinados para acontecer. Caso este evento seja iniciado precocemente e/ou em local não apropriado, pode ocorrer exaustão do espermatozóide e falha no processo de fertilização. Condições físicas e a constituição química do meio tem muita influência sobre o início e a manutenção da motilidade característica deste processo assim como a participação do cálcio extracelular, adenilato ciclase, cAMP, proteína kinase e a fosforilação de proteínas (Tash, 1989; Bedford & Hoskins, 1990). Evidências indicam uma forte correlação entre a habilidade do espermatozóide em disparar a hiperativação e sua capacidade em fertilizar oócitos com zona pelúcida intacta. Esta primeira fase do processo se completa com o reconhecimento e passagem do espermatozóide através das células foliculares. O cumulus é formado por células e por matriz extracelular, cujo maior componente é o ácido hialurônico conj ugado com proteínas (Piko, 1979). Sob condições naturais in vivo, muito poucos espermatozóides chegam nas proximidades do oócito no momento da fertilização. Austin (1960) foi um dos primeiros a descrever que o espermatozóide precisa estar "capacitado" para que possa penetrar no cumulus. No entanto, para que sejam capazes de penetrar as células do cumulus deverão apresentar acrossomas intactos. Controvérsias ainda permanecem em relação ao mecanismo de travessia dos espermatozóides através das células do cumulus. No geral, duas teorias são lançadas: a primeira relacionada a um processo meramente mecânico e a segunda sob ação da hialuronidase. Talbot et al. (1985) atribuíram a esta enzima um efeito colaborador mas não essencial ao processo. Estudos descrevem ainda que nesta fase, ocorre a utilização da hialuronidase localizada na superfície do espermatozóide (e não aquela presente no acrossoma).Outras enzimas de superfície incluindo a acrosina, β-galactosidase e arilsulfatase, também parecem estar implicadas neste evento. Estas enzimas são adsorvidas pelo gameta masculino no decorrer da espermatogênese e durante o percurso até a uretra. Uma vez entre as células do cumulus, o espermatozóide forma um caminho e consegue chegar nas proximidades da zona pelúcida, visando o próximo passo.
Fase 2 - na Zona Pelúcida
A zona pelúcida (ZP) é uma camada acelular glicoproteica que envolve o oócito e restringe a fecundação inter-espécie, além de proteger o embrião de danos físicos. Apesar da fertilização normal poder acontecer sem a ZP, esta estrutura parece ser essencial para o desenvolvimento pre-implantacional do embrião. Sem ZP, pode acontecer a dissociação e perda dos blastômeros, assim como a adesão do embrião em qualquer local durante seu trajeto. Possui receptores específicos aos espermatozóides e é a estrutura responsável pelo desencadeamento de uma cascata de eventos moleculares que transforma o oócito e impede a entrada de outros espermatozóides. A natureza química das moléculas da ZP responsáveis pela ligação com o espermatozóide foi inicialmente estudada em camundongos. De acordo com a literatura, duas moléculas parecem expressar funções de ligação com espermatozóides: ZP2 e ZP3 (Wassarman et al., 1985a; 1985b; 1987; 1988; 1990; 1991). Acredita-se que a ZP3 seja de fato a proteína de ligação com interação direta com a membrana externa intacta do acrossoma e a ZP2 é o ligante secundário que se une com a membrana interna do acrossoma, logo após a reação acrossômica (Calogero et al., 2000; Son et al., 2000).
Fase 3 - da Zona Pelúcida à entrada de um espermatozóide
A primeira resposta da ZP é chamada Reação de Zona, caracterizada por uma mudança estrutural nas glicoproteínas estruturais, tornando-a impermeável a outros espermatozóides. A ligação entre essas duas estruturas (membrana plasmática externa do acrosoma do espermatozóide e ZP) desencadeia um evento irreversível: a reação acrossômica, que é caracterizada pela exocitose de vacúolos e ativação da maquinária enzimática necessária para que o espermatozóide possa atravessar a ZP (Flesh & Gadella, 2000). Assim como a capacitação, a reação acrossômica parece ser controlada por modificações dos níveis de cálcio intracelular e outros íons, pela transferência de lipídios e fosfolipídios remodelando a membrana plasmática e pela fosforilação de proteínas (Baldi et al., 2000). Após ter conseguido atravessar a ZP o espermatozóide está prestes a fundir-se com o oócito.
Fase 4 -Fusão das membranas plasmáticas
A reação acrossômica é um pré-requisito absoluto para a fusão entre o espermatozóide e o oócito (Yanagimachi, 1981; 1988). Neste momento, os níveis de cálcio intracelular aumentam e ocorre a fusão entre as duas unidades de membrana. Todo o conteúdo do gameta masculino é depositado no interior do ooplasma, enquanto que a membrana plasmática da célula masculina é incorporada ao oolema e servirá para permitir um discreto crescimento embrionário durante a clivagem.
Além do material genético, o espermatozóide deposita o centríolo, que será de fundamental importância para a aproximação dos pronúcleos e formação do fuso de divisão celular, em etapas subsequentes. Imediatamente após a entrada de um espermatozóide ocorre uma onda de despolarização de membrana, visando o bloqueio à polispermia (bloqueio rápido). Uma segunda resposta refere-se à extrusão de grânulos corticais com enzimas lisosomais próximo à membrana plasmática do oócito, diretamente no espaço perivitelino, causando alterações importantes no oolema (bloqueio lento à polispermia). Esta reação é uma das consequências da ativação oocitária. O oócito, no entanto, pode ser ativado por vários estímulos artificiais (físicos ou químicos) que não pela entrada do espermatozóide. Em relação à fecundação normal, a maneira pela qual o espermatozóide induz a ativação oocitária, pode ser analisada sob diferentes aspectos. Primeiramente, ocorre a ligação de ligantes do espermatozóides com um ou mais receptores do oolema, iniciando a ativação oocitária. Esses receptore oocitários, fazem parte da superfamília das integrinas (fertilinas) e encontram-se ligados ou à proteína G ou à tirosina kinase (Tesarik, 1998). Todo esse processo envolve também a mobilização do cálcio intracelular (hipótese da ativação através dos receptores de membrana) (Esquema II). Outra hipótese está relacionada à ativação oocitária mediada por fatores solúveis ativadores de oócitos liberados no ooplasma pelo espermatozóide, e é a que explica a ativação do oócito independentemente da ligação com espermatozóide, a exemplo do que ocorre durante a partenogênese, na ativação artificial e até mesmo na ICSI. Acredita-se que, em humanos, os dois eventos ocorrem de forma complementar (Tesarik, 1998). Um destes fatores - a oscilina - parece estar diretamente relacionado à ocorrência das oscilações de cálcio intracelular. (Esquema II). Além de complexos, os eventos que possibilitam a fusão entre as membranas dos dois gametas, são praticamente simultâneos, conforme mostra o esquema I, abaixo:
Esquema I. Possível relação et/lre a capacitação espermálica, reação acrossômica e hiperativação (Yanagimachi, 1981)
Esquema II. mostrando a reação em cascata dentro do ooplasma em resposta à entrada de um espermatozóide.
Participação do cálcio:
Como já foi observado, para que ocorra a fusão entre as membranas plasmáticas do oócito e do espermatozóide, é necessário que a reação acrossômica já tenha ocorrido. Uma vez em contato com o espermatozóide, o oócito outrora quiescente inicia uma série de eventos morfológicos e bioquímicos que permitem divisão e, consequentemente, a diferenciação celular e a formação do novo indivíduo (Levasseur & McDougall, 2000; Beckhelling et al., 2000). Este processo é referido como ativação. O estudo deste processo foi iniciado por volta dos anos 80 (Miyazaki et al., 1981) em hamsters e camundongos. Desde então, atribuiu-se ao cálcio um papel de extrema importância. Acredita-se que, ondas de hiperpolarização da membrana oocitária concomitantes ao aumento dos níveis de cálcio sejam os eventos responsáveis pelo processo de fusão entre as membranas. Imediatamente após a ligação receptorligante (oócito - espennatozóide), canais iônicos da membrana do espennatozóide são incorporados ao oolema, pennitindo uma continuidade elétrica entre os dois gametas. (McCulloh et al., 1992). Este fato causa uma abertura temporária de canais para sódio e a ativação de canais para cálcio, resultando em uma despolarização do oolema. A despolarização desta membrana, por sua vez, previne a entrada de novos espennatozóides (bloqueio rápido á polispennia). A interação entre o espennatozóide e o oócito estimula a quebra do fosfatidil inositol difosfato (P1P2) via cascata da proteína G/fosfolipase C, com uma resultante produção de inositol trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG) (Jaffe, 1983; Swann & Whitaker, 1990; Turner & Jaffe, 1989). IP3 estimula a liberação do cálcio intracelular, induzindo a reação cortical, causando uma elevação e um endurecimento do envelope do zigoto (bloqueio lento á polispennia). O DAG estimula a bomba de sódio/potássio e isto causa um aumento no pH intracelular. Consequentemente, o zigoto inicia a síntese de DNA e de proteínas, assim como outros processos. O aumento do cálcio começa na região próxima ao sítio de entrada do espermatozóide e se espalha rapidamente por toda a membrana (ondas de cálcio). Ocorre então uma oscilação nos níveis deste íon em intervalos mais ou menos regulares (Deng & Shen, 2000; Levasseur & McDougall; 2000. Cada elevação transitória de cálcio é devida ao IP3 que propicia a liberação do cálcio armazenado no interior da célula. No entanto, a continuidade de repetidas elevações transitórias de cálcio parece ser dependente do cálcio extracelular. Miyazaki et al., 1981, postularam que a fusão entre os dois gametas causa um aumento contínuo na penneabilidade da membrana plasmática do oócito ao cálcio assim como pennite a produção contínua de IP3. O interessante é que, a utilização dos estoques do cálcio intracelular media a entrada do cálcio do meio externo, assim como os níveis de IP3. A proteína kinase C ativada pelo DAG e pelo cálcio livre pode quebra o equilíbrio entre a fosforilação e a defosforilação proteica, pennitindo uma modulação dos canais iônicos da membrana plasmática e a inativação do MPF (fator promotor de metáfase) e do fator citostático (CSF), levando à ativação do zigoto, que irá terminar a meiose e liberar o outro corpúsculo polar (Esquema II).
Comentários:
Recentes avanços tem sido conseguidos no estudo dos eventos que caracterizam o processo de fertilização. E consenso afinnar que, somente espennatozóides extremamente competentes conseguem "vencer" a árdua batalha de atravessar as intennináveis barreiras oocitárias, para que possa despejar seu conteúdo genético e seus fatores solúveis e ativadores, contribuindo para o início da vida de um novo indivíduo.
Existe portanto, sabidamente, um processo de seleção natural daqueles espennatozóides que se mostram mais aptos para fertilização, ou seja: os mais móveis, com estrutura morfologica e funcional adequadas, capazes de desencadear reações bioquímicas em tempo e local detenninados.
Assim, o espennatozóide que fertiliza deverá ser capaz de direcionar e iniciar a oscilação de cálcio e também modificar as propriedades de um ou mais elementos de regulação da homeostase deste íon (bombas, canais e receptores das membranas plasmáticas das organelas de reserva - retículo endoplasmático - por exemplo) a fim de pennitir a continuidade das oscilações do cálcio.
Com o surgimento da fertilização in vitro convencional - FIV (Steptoe & Edwards, 1978), houve uma otimização neste processo. No entanto, um certo grau de seleção natural ainda persiste, tendo em vista a alta incidência de falhas de fertilização. Quando Palenno e colaboradores, em 1992, instituíram a injeção de um único espennatozóide dentro de um citoplasma oocitário através da ICSI, todas as barreiras naturais ao espennatozóide foram transpostas.
A experiência com ICSI indica que o espennatozóide injetado no citoplasma do oócito é capaz de induzir as oscilações de cálcio de uma maneira muito semelhante ao processo in vivo, mesmo sem ter tido contato com receptores de ZP e de membrana plasmática, reforçando a participação de fatores que iniciam as oscilações de cálcio, através de um mecanismo independente da interação cntre receptores e ligantes de membrana plasmática. Acredita-se que, a entrada da pipeta através do oolema, por si só, parece funcionar como um bom estímulo da maquinaria do cálcio.
Quebrar a cauda dos espennatozóides antes da ICSI, além de visar sua imobilização, facilita a desintegração do espennatozóide no ooplasma e consequentemente a liberação dos fatores solúveis, material genético e centríolo.
Outro artifício recomendado pela técnica refere-se à vigorosa aspiração do citoplasma antes da injeção de espennatozóides independentemente do local de origem (ejaculado, testículo ou epidídimo)justamente para "comunicar" o oócito a entrada do gameta masculino.
Sendo assim, através da ICSI, o espennatozóide consegue desempenhar seu papel dentro do oócito e pennitir o desenvolvimento de embriões saudáveis, mimetizando as condições fisiológicas. Mesmo assim, falhas neste processo ainda ocorrem e provavelmente são devidas à ativação anonnal ou incompleta, que impedem o controle e a modulação de todos os elementos citados neste artigo.
Referências Bibliográficas
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Talbot P. - Sperm penetration through oocyte investimets in mammals. An J Anat., 174: 331-346, 1985.
Wassarman P. M. - The biology and chemistry of fertilization. Science 235: 553-560, 1987
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