JBRA Assist. Reprod. 2001;05(01):39-41
RELATO DE CASO
doi: 10.5935/1518-0557.2001.5.1.09
Resumo
O propósito deste trabalho é relatar a ocorrência de uma gravidez de feto único em programa de ICSI com a utilização de ovócitos criopreservados pelo método de vitrificação.
Unitermos: congelamento de ovócitos, vitrificação.
Abstract
The purpose of this paper is to report a successful pregnancy stabilishment on a ICSI program, using oocytes cryopreserved by vitrification.
Key Words: oocyte cryopreservation, vitrification.
Introdução
O congelamento de ovócitos humanos tem sido uma meta perseguida por muitos pesquisadores pois representa a solução, para uma série de problemas éticos decorrentes do congelamento de embriões, como também uma alternativa para pacientes que desejam postergar a gravidez, seja por razões profissionais ou de relacionamento, seja por problemas de saúde.
A simples adaptação dos protocolos de congelamento lento utilizados para embriões mostrou-se ineficiente no caso de ovócitos. Porcu et al. (1998) relatou o nascimento de seis bebês resultantes de 709 ovócitos descongelados (0.85%). Tucker et al. (1998), utilizando uma técnica similar conseguiu um resultado positivo em 1-2% dos mais de 400 ovócitos descongelados.
Em 1998, a equipe do Dr. Kwang Y. Cha apresentou no congresso mundial em San Francisco uma nova técnica de congelamento de ovócitos humanos, baseada no trabalho de Martino et al. (1996) desenvolvido com ovócitos bovinos (Hong et al., 1999). A técnica consistia no congelamento por vitrificação, utilizando como recipientes minúsculas telas de cobre (copper grids) usadas em microscopia eletrônica. Esta técnica apesar de muito eficiente apresenta elevado custo e é de difícil execução, portanto inadequada à prática diária dos centros de reprodução assistida. No mesmo ano Vajta et al. (1998), trabalhando com bovinos, lança a técnica OPS (open pulled straw, pipeta filamentar aberta), muito mais barata e prática que apresentou resultados satisfatórios.
No presente trabalho, relatamos uma gravidez obtida com a utilização de ovócitos congelados por vitrificação, utilizando uma adaptação da técnica de Vajta et al. (1998).
Descrição do caso - Estimulação ovariana
Paciente com 37 anos, casada há dois anos procurou nosso serviço, em setembro de 1998, com desejo de congelar seus ovócitos devido a condições particulares e profissionais.
A estimulação ovariana consistiu na utilização de um protocolo longo com administração diária subcutânea de acetato de leuprolide (Lupron; TAP Pharmaceutical, Abbot Laboratories, North Chicllgo, USA) na dose de 0.5 mg a partir do vigésimo terceiro dia do ciclo menstrual e continuando até o início da menstruação seguinte. No terceiro dia de sangramento foi realizada ultra-sonografia endovaginal, dosagem sérica de estradiol e progesterona quando foi constatado a dessensibilização da hipófise acompanhada pela ausência de cistos ovarianos. O uso do Lupron foi interrompido e foi iniciado a estimulação folicular com FSH purificado (Metrodin; Laboratórios Serono, São Paulo, Brasil).Quando três folículos co-dominantes alcançaram diâmetro médio superior a 18 mm, 10.00 UI de hCG (Profasi; Laboratórios Serono, São Paulo, Brasil) foi administrado. A coleta dos ovócitos foi realizada por via transvaginal sob controle ultrasonográfico e sedação-analgesia endovenosa 35 h após a administração do hCG. Os ovócitos foram identificados e incubados em estufa (37°C, 5% CO2) por três horas.
Criopreservação dos ovócitos
Três horas após a coleta dos ovócitos, as células do cumulus e corona foram removidas por incubação durante um período de 30 a 60 segundos em HTF-Hepes (Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA) suplementado com 15% (v/v) de SSS (Synthetic Serum Substitute- Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA) e 80 UI de hyaluronidase (Tipo VIII; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA, n° H-3757), seguida por remoção mecânica com a utilização de pipetas de vidro afiladas ao fogo.
O protocolo de congelamento seguiu uma adaptação dos métodos descritos por Vajta et al. (1998) e Hong et al. (1999).
Onze ovócitos maduros foram vitrificados com adição de crioprotetores em 3 etapas. A solução base era composta de HTF-Hepes suplementado com 20% de SSS. As soluções de vitrificação I, II e III eram compostas pela solução base mais a adição de 10, 20 e 40% (v/v) de etileno glicol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA; E-9129), respectivamente. A solução III foi adicionalmente suplementada com IM de sacarose (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA; S-9378). Primeiramente os ovócitos foram transferidos para a solução base e permaneceram por um período de 5 minutos. Em seguida, eles foram transferidos para as soluções I e II permanecendo nestas soluções por 5 e 2 minutos, respectivamente. Após esta etapa, os ovócitos foram transferidos para a solução III, aspirados para o cateter de congelamento e imediatamente mergulhados em nitrogênio líquido a - 196º C. Ao invés de usar o OPS desenvolvido por Vajta et al. (1998), nós utilizamos o cateter Tom Cat (Sherwood Medical, St Louis, MO, USA) como recipiente. A etapa III, incluindo o carregamento do cateter durou no máximo 60 segundos. Toda a fase de adição de crioprotetores se processou à temperatura ambiente.
Descongelamento e Fertilização
Em março de 2001 (30 meses após), os II ovócitos foram descongelados segundo o método de Hong et al. (1999). O conteúdo dos cateteres contendo os ovócitos vitrificados foi transferido para soluções com concentrações decrescentes de sacarose (1M, 0.5M, 0.25M e 0. 125M), mantidas aquecidas a 37°C, em intervalos de 2.5 minutos. Em seguida, os ovócitos foram lavados em três placas adicionais contendo o meio base. Após isto, os ovócitos foram transferidos para placas de cultivo contendo HTF (Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA) suplementado com 15% de SSS, até o momento da fertilização. Utilizou-se a técnica da injeção única de espermatozóide no citoplasma oocitário (ICSI) convencional com o corpúsculo polar posicionado às 12 horas.
Cultivo
Após a injeção dos espermatozóides, os ovócitos foram cultivados em HTF suplementado com 15% de SSS a 37°C e 5% de CO2 quando os pré-embriões foram transferidos para a paciente no estágio de 4 células.
Resultados
De 11 ovócitos vitrificados, 5 resistiram ao descongelamento (45 .5%), ou sej a, apresentavam zona pelúcida intacta, citoplasma claro e translúcido. Estes 5 ovócitos foram submetidos à ICSI e 4 apresentaram dois pró-núcleos de aspecto normal após 18 horas de desenvolvimento in vitro (80%). Quatro pré-embriões, no estágio de 4 células, foram transferidos para o útero da paciente, o que resultou no desenvolvimento de um feto aparentemente normal, no presente momento no estágio de 12 semanas, com translucência nucal normal (1.8 mm).
Discussão
A criopreservação de ovócitos humanos ainda representa um desafio, apesar dos esforços dos pesquisadores desde o primeiro relato de Chen et al. (1986). Os ovócitos são mais sensíveis ao processo de congelamento do que os embriões. Todos os ovócitos maduros são vulneráveis à crio-injúria porque o fuso que mantém os cromossomos na placa metafásica despolimeriza com a diminuição da temperatura (Eroglu et al.,1998). Os protocolos de congelamento lento podem ser prejudiciais aos ovócitos por proporcionarem longos períodos de exposição à baixas temperaturas. Sendo assim, procedimentos que utilizam o congelamento ultra-rápido poderiam ser uma boa alternativa (Shaw et al., 2000).
As primeiras tentativas de vitrificação de ovócitos humanos não obtiveram resultados satisfatórios, possivelmente devido aos efeitos tóxicos das altas concentrações de crioprotetores (Hunter et al.,1995). Mesmo a utilização de crioprotetores menos tóxicos e a diminuição do tempo de exposição aos mesmos, não foram suficientes para viabilizarem a vitrificação em palhetas (straws) (Chen et al., 2000).
Martino et al. (1996) propôs que a diminuição do volume de solução vitrificada e o concomitante aumento da taxa de resfriamento ajudariam os ovócitos a ultrapassarem a temperatura mais crítica, que seria entre + 15°C e - 15°C. Estratégias para a redução do volume, tais como o uso das telas de cobre (Hong et al., 1999) ou fio de nylon em laço (cryoloop) (Lane et al., 1999), apesar de efetivas são caras e de difícil execução. A técnica OPS, por utilizar um recipiente barato e de fácil manuseio, mostrou-se prática e efetiva, tanto no congelamento de ovócitos bovinos (Martino et al., 1996), como no congelamento de ovócitos humanos (Kuleshova et al., 1999). No presente trabalho relatamos uma gravidez decorrente da utilização de ovócitos vitrificados através de uma adaptação da técnica OPS. As taxas de sobrevivência (45,5%), fertilização (80%) e clivagem (100%) se aproximam das apresentadas por Kuleshova et al.(1999), de 65%, 66.7% e 50%, respectivamente. Este relato confirma o potencial do uso da vitrificação de ovócitos para pacientes de programas de FIV; seja antes dos tratamentos de radioterapia ou quimioterapia, ou no caso de pacientes que desejam retardar a gravidez por outras razões, como por exemplo para fins de doação quando o desenvolvimento endometrial da receptora não foi sincronizado ao desenvolvimento folicular da doadora.
Referências
Chen C. Pregnancy after human oocyte cryopreservation. Lancet, 1, 884-886, 1986.