JBRA Assist. Reprod. 2001;05(02):60-63
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2001.5.2.03
Transplante ovariano autólogo em peritônio de ratas
Intraperitoneal ovarian transplantation in rats
1Mestre em Ginecologia pela Faculdade de Medicina da UFMG
2Aluno de graduação da Faculdade de Medicina da UFMG
3Diretor da Clínica ORIGEN
4Professor Adjunto Doutor do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina da UFMG - Bolsista do CNPq
Resumo
O objetivo deste estudo foi checar a viabilidade do transplante ovariano autólogo em ratas albinas. Sessenta ratas albinas foram divididas em 3 grupos. Grupo I (n=20) submetida à ooforectomia bilateral. Grupo II (n=20) foram submetida à uma laparotomia exploradora para inspeção dos ovários (controle). Grupo III (n=20) receberam fragmento de ovário autólogo, colocado na cavidade peritonial após ooforectomia bilateral. Foi realizado esfregaço vaginal diariamente durante 5 dias, começando 8 a 14 dias após a cirurgia, para checar a presença de ciclos de estral. Uma semana após o final dos esfregaços vaginais foram autografados, cortados e histologicamente estudados. Dezoito ratas (90%) grupo I apresentaram padrão persistente de atrotla nos esfregaços vaginais. Dois mostraram sinal de cornitlcação inicial do epitélio vaginal, sem, no entanto serem observados ciclos estrais típicos. Quinze (75%) do grupo II apresentaram regulares ciclos estrais. Cinco (25%) mostraram irregulares ciclos. Dezesseis (80%) do grupo III encontraram regulares e4 (20%) apresentaram ciclos irregulares. Usando um modelo de regressão lógica, foi demonstrado que não tinha signiticante diferença entre os grupos II e III, onde os animais apresentaram ciclos irregulares (p= 0.4862). Foram observados folículos até os estágios estrais avançados de desenvolvimento e corpos lúteos nos implantes estudados. Concluímos que o transplante ovariano autólogo em ratas castradas, restaura o ciclo estral e apresentam desenvolvimento ovulatório normal.
Unitermos: transplante ovariano, ovário, ratas
Abstract
The aim of this study was to check the viability of intraperitoneal ovarian autotransplantation in albine rats. Sixty female albine rats were shared in three groups. Group 1 (n=20) was submmited to ovariectomy. Group 2 (n=20) was shamoperated. Group 3 (n=20) received an autograft of an ovarian fragment, attached to the peritoneal surface, after ovariectomy. Vaginal smears were made daily, for 5 days, starting, at least, 8 days the surgery, in order to check the presence of oestral cycles. One week after the end of the vaginal smears, the autografts were excised and histologicaly studied. Eighteen rats (90%) of the group 1 showed a persistent atrophic pattern in the vaginal smears. Two showed signs of cornification of the vaginal epithelium, but they did not present a complete oestral cycle. Fifteen rats (75%) of group 2 presented a regular oestral cycle and 5 (25%) showed irregular cycles. Sixteen rats (80%) of group 3 showed regular oestral cycles, and 4 (20%) animals had irregular cycles. Using the logistic regression model, it was demonstrated no significant difference between group 2 and 3, in which concern the number of animals that presented irregular cycles (p value = 0,4862). Ali but one graft had follicles in all stages of development, including advanced antral stages. It was also showed many corpora lutea in all grafts. It was concluded that intraperitoneal ovarian autotransplantation, in castrated female rats, restores the oestral cycling and shows normal follicle development.
Key words: ovarian transplantation, ovary, rats
Introdução
Um dos principais problemas enfrentados pela medicina reprodutiva, atualmente, é a preservação da função ovariana. A reserva de gametas vai se esgotando ao longo do menacme, atingindo a completa exaustão na pós-menopausa (Faddy et al., 1992). Algumas situações, como cirurgias e doenças auto imunes, podem levar a uma perda precoce desta função reprodutiva das gônadas femininas. Assim, a única opção atual, para viabilizar a concepção em mulheres vítimas de uma falência ovariana prematura ou fisiológica, é a doação de oócitos. A terapia de reposição hormonal seria responsável para a manutenção dos efeitos estrogênicos sobre os vários sistemas, em especial, o aparelho cárdiovascular e os ossos. Algumas estratégias potenciais poderiam criar novas alternativas para ajudar esse grupo de pacientes. A criopreservação de embriões após fertilização in vitro poderia servir como alternativa para pacientes adultas com relacionamento estável. A criopreservação de oócitos maduros (metáfase II) é uma técnica que já vem sendo empregada com sucesso em animais de laboratório, porém, com pobres resultados, em humanos (Nagy et al., 1996). A maturação in vitro de oócitos na prófase I vem sendo estudada em alguns serviços (Mandelbaum et al., 1988; Toth et al., 1994; Son et al.1996). A vantagem teórica da utilização de gametas nesse estágio de desenvolvimento, é que ele ainda não formou o fuso mitótico, com isso não haveria o risco de lesão dessa estrutura, durante o processo de congelamento. Não existem gestações em humanos, com esta técnica, utilizada após o congelamento até o momento (Cha et al., 1991; Trounson et al., 1994; Gook et al., 1995). Ainda, dentro desse raciocínio, a utilização de folículos primordiais seria ainda mais vantajosa. Eles têm 1 % do volume de um folículo com oócito maduro, são menos diferenciados, possuindo menos organelas, não possuem uma zona pelúcida e não têm o fuso mitótico formado (Oktay et al., 1998). Eles seriam congelados em finos fragmentos de córtex ovariano ou seriam isolados com uma única camada de células da granulosa, após incubação em enzimas proteolíticas. Após o descongelamento seriam, então, transplantados ou maturados e fertilizados in vitro. Poucos experimentos foram realizados até o momento, somente em animais, sendo que nenhum foi feito após congelamento (Carroll & Gosden, 1993; Eppig & O'Brien, 1996).
A criopreservação de tecido ovariano seria uma alternativa interessante. Além de ser um processo de maior simplicidade, possibilitaria, não só o retorno da função reprodutiva, como também da função endócrina. O tecido ovariano seria congelado em pequenos fragmentos e, após o descongelamento, transplantado para a própria paciente ou para um animal imunodeficiente (xenotransplante), onde os oócitos seriam maturados in vivo e coletados para a realização de fertilização in vitro.
Entre as pacientes que se beneficiariam do uso dessas técnicas estão as pacientes jovens com neoplasias como linfomas e leucemias, uma vez que suas gônadas sofreriam os efeitos da quimioterapia e da radioterapia, muitas vezes irreversíveis. Também as pacientes portadoras de neoplasias ginecológicas, c ujos ovários devem ser extirpados durante a abordagem cirúrgica da doença, seriam outro alvo de preocupação, quanto a preservação da função ovariana. Ainda, como candidatas à utilização desses recursos, estariam aquelas mulheres que retardam a concepção para um período avançado da vida reprodutiva, quando haveria um risco maior de falência ovariana.
O transplante de tecido ovariano surge como uma consequência natural do desenvolvimento das técnicas de criopreservação, sendo uma técnica fundamental para viabilizar a sua utilização. A realização desse transplante sem reanastomose vascular, para a superfície peritonial terá a vantagem de ser um procedimento simples, que poderá possibilitar a restauração da fertilidade natural.
Assim, o objetivo do nosso estudo foi verificar a viabilidade funcional do transplante ovariano autólogo para o peritônio de ratas, sem anastomose vascular, através de citologia vaginal funcional seriada e estudo histológico dos implantes.
Material e métodos
Um total de 60 ratas albinas, nuligestas, da variedade Holtzman, com a mesma idade (60 dias de vida) e pêso, foram aleatoreamente divididas em 3 grupos de 20. No grupo 1 foi realizada ooforectomia bilateral. No grupo 2, foi realizada laparotomia e inspeção dos ovários (controle). No grupo 3 foi realizada ooforectomia bilateral, seguida de transplante de metade de um dos ovários para a superfície peritonial, à esq uerda do feixe vásculo-nervoso hipogástrico esquerdo (transplante). Os animais foram operados em conjuntos de 6, todos pertencendo à mesma ninhada, sendo 2 para cada um dos grupos de estudo, escolhidos de forma aleatória. Dessa maneira, os 3 grupos foram emparelhados quanto à idade das ratas; à habilidade do cirurgião, no decorrer do experimento; e ao tempo decorrido entre a cirurgia e o início da citologia vaginal.
Todas as ratas foram mantidas em regime luz/escuridão de 12/12 horas e alimentadas com ração (Nuvilab) e água ad libitum. Após um intervalo de 8 a 14 dias da cirurgia, realizou-se citologia vaginal funcional, por 5 dias seguidos, nos três grupos.
As ratas do grupo 3 (transplante) foram sacrificadas após a citologia e tiveram os seus implantes ovarianos excisados e estudados histologicamente, para a pesquisa de folículos nos vários estágios de desenvolvimento e de corpos lúteos. Utilizou-se um modelo de regressão logística para medir a interferência do peso dos animais e do tipo de intervenção cirúrgica (transplante x controle) no tipo de ciclo estral (regular x inadequado). A significância estatística foi considerada quando p < 0,05.
Resultados
Não houve diferença significativa entre o peso dos três grupos, pela análise de variância (p = 0,432), como verificado na Tabela I.
Tabela I. Distribuição do pêso das ratas de acordo com o grupo estudado
No grupo 1 (ooforectomia), 18 (90%) das 20 ratas apresentaram um padrão persistente de atrofia na citologia vaginal e 2 (10%) apresentaram uma cornificação vaginal inicial, sem, no entanto, serem observados ciclos estrais típicos. No grupo 2 (controle), 15 (75%) das 20 ratas apresentaram ciclos estrais regulares e 5 (25%) apresentaram ciclos inadequados. Nenhuma das ratas do grupo controle apresentou padrão atrófico na citologia vaginal. No grupo 3 (transplante), 16 (80%) das 20 ratas apresentaram ciclos regulares e 4 (20%) apresentaram ciclos inadequados. Nenhuma rata do grupo transplante apresentou citologia vaginal de padrão atrófico (Tabela 2).
Tabela II. Ciclo estral nas ratas de acordo com os grupos de estudo
Como pode ser verificado na Tabela 3, não houve efeito significativo do tipo de intervenção cirúrgica (laparotomia branca x transplante) no ciclo das ratas (p = 0,4862). Ou seja, não se verificou diferença significativa no número de animais com ciclo inadequado entre os grupos 2 (controle) e 3 (transplante), sendo que a porcentagem de ratas com ciclo inadequado, no grupo 2 foi maior do que no grupo 3 (25 x 20%).
Tabela III. Resultado do Ajuste do Modelo de Regressão Logística de acordo com o grupo de estudo e o pêso das ratas
Foram observados folículos até os estágios estrais avançados de desenvolvimento (grandes folículos antrais) e corpos lúteos em 19 dos 20 implantes estudados. Em um dos implantes não foi possível encontrar tecido ovariano em nenhum corte histológico. Verificou-se uma grande quantidade de vasos sanguíneos, em todos os cortes de todos os implantes, traduzindo a intensa revascularização dos tecidos.
Discussão
O transplante ovariano sem reanastomose vascular, para a superfície peritonial tem algumas vantagens. É um procedimento simples, que evita a utilização das complexas técnicas e do material de microcirurgia, tem a possibilidade de restaurar a fertilidade natural, sem a necssidade do uso de técnicas de fertilização assistida e ainda, pode-se aproveitar a abordagem cirúrgica do câncer para a obtenção do tecido ovariano.
Os resultados desse estudo mostraram função ovariana endócrina preservada, após o transplante, sem reanastomose vascular, para a superfície peritonial (grupo 3), comparável à do grupo controle (grupo 2), no qual os ovários foram mantidos intactos. Não houve díferença significativa no número de ciclos regulares nos dois grupos citados. Quinze das vinte ratas do grupo controle (75%) apresentaram ciclos estrais regulares pela citologia vaginal funcional seriada, enquanto dezesseis das vinte ratas do grupo transplante (80%) apresentaram ciclos regulares. A citologia vaginal funcional seriada traz uma evidência indireta da função ovariana, através do estudo dos efeitos dos esteróides ovarianos em um órgão alvo, no caso o epitélio vaginal. Goldman et al. (1969) e Butcher et al. (1974) mostraram boa correlação da citologia vaginal com os níveis hormonais de esteróides ovarianos, gonadotrofinas e prolactina, durante o ciclo estral da rata. Somada a essa prova indireta da função endócrina do ovário, demonstramos uma evidência histológica de desenvolvimento folicular normal e ovulação em todos, menos um dos implantes (95%). Este fato pode ser explicado por uma possível falha na técnica de separação do material a ser analisado, e não à técnica do transplante.
Duas ratas (10%) do grupo I (ooforectomia) não apresentaram padrão de atrofia vaginal na citologia seriada, como seria de se esperar. Isso ocorreu, possivelmente, devido à presença de tecido ovariano remanescente, após a ooforectomia.
Apesar do sucesso do transplante, observado no presente estudo, o tempo de seguimento foi de apenas um ciclo cetral (5 dias), não sendo possível tirar qualquer conclusão a respeito da duração da função do implante ovariano.
Outros autores (Camilieri et al., 1976; Baird et al., 1996; Callejo et al., 1999) realizaram estudos com transplante ovariano autólogo para a superfície peritonial, mostrando função endócrina do implante por até 22 meses.
Outra alternativa razoável para o sítio de implantação do ovário seria o tecido subcutâneo. A monitorização ecográfica do crescimento folicular e a captação oocitária seriam bastante simplificadas. Vários autores obtiveram sucesso com o transplante ovariano para esse sítio, com ou sem reanastomose vascular (Deanesly, 1954; Parkes, 1956; Green et al., 1956; Tobias et al., 1994; Gallaghier et al., 1995; Von Eye Corleta et al., 1998), sendo que Von Theobald et al. (1987) demonstraram crescimento folicu lar e ovulação, através de controle ecográfico, em um transplante autólogo de ovário, com reanastomose vascular, para o subcutâneo da face interna do braço de uma mulher.
Um ponto a ser considerado, no uso de tecidos em portadoras de doenças malignas, é a possibilidade de recidiva da doença, após o transplante. Shaw et al. (1996) mostraram a transmissão de linfoma, em 7 de 7 fêmeas de camundongos, após transplante de tecido ovariano fresco e em 6 de 7 destes animais, que receberam transplante após congelamento. O uso de drogas citotóxicas nos fragmentos a serem transplantados seria uma opção para a diminuição desse risco, entretanto, elas inibem o processo natural de neovascularização do implante, o que é necessário para que ele restabeleça sua função.
Nenhuma gravidez em humanos, com transplante ovariano autólogo, após congelamento, foi relatada até o momento, sendo necessários mais estudos para verificar o potencial de maturação, fertilização e de produzir desenvolvimento embrionário adequado.
Além do benefício para as mulheres submetidas a tratamento com quimioterapia, radioterapia ou castração cirúrgica, e que poderão ter sua fertilidade mantida, outras perspectivas futuras surgem para o uso do transplante ovariano. A sua utilização em substituição à terapia de reposição hormonal do climatério, seria uma alternativa mais fisiológica. Com o desenvolvimento de novas drogas imunossupressoras, cada vez mais potentes e com menos efeitos colaterais, para a prevenção da rejeição de tecidos não-aulólogos, e com o aperfeiçoamento das técnicas de criopreservação e de crioprotetores, poderia se pensar em um banco de tecido ovariano. Entre as pacientes que se beneficiariam da existência desse tipo de banco estão as portadoras de disgenesia gonadal e aquelas com falência ovariana precoce.
Podemos concluir que o transplante ovariano autólogo, sem reanastomose vascular, em peritônio de ratas castradas, restaura o ciclo estral e o desenvolvimento folicular adequado.