JBRA Assist. Reprod. 2001;05(03):106-110
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2001.5.3.04
1The Jones Institute for Reproductive Medicine
2Androlab - Clínica de Reprodução Humana e Andrologia
Resumo
O estudo dirigido foi para analisar os resultados de ciclos de ICSI em casais em que o diagnóstico principal de infertilidade foi azoospermia obstrutiva e não obstrutiva.
Significativamente baixa a taxa fertilização (64% vs. 73%, p= 0.02), taxa gravidez clínica (13% vs.47% p<0.001) e taxa de embriões de boa qualidade (35% vs 56%, p=0.009) foram observadas em pacientes com azoospermia não obstrutiva. Em pacientes com azoospermia obstrutiva não foram observadas diferenças signiticantes quando os resultados foram analizados baseados na origem do esperma de TESE ou MESA. Em conclusão, quando, associamos TESE ou MESA com ICSI em pacientes com azoospermia obstrutiva os resultados em termos de fertilização, implantação e taxa de gravidez são similares aquelas encontradas em pacientes não azoospérmicos que tenha sido submetida à ICSI com esperma ejaculado. Casos de azoospermia não obstrutiva apresentam baixa fertilização, qualidade embrião e taxa gravidez do que azoospermia obstrutiva, provavelmente devido à defeitos severos na espermatogênese para qualidade inferior do gameta.
Unitermos: Azoospermia obstrutiva, não-obstrutiva, espermatozóide testicular, ICSI
Abstract
The aim of this study was to analyze the outcome of ICSI cycles in infertile couples in which the main diagnosis of infertility was azoospermia of obstructive and non-obstructive origin.
Significantly lower fertilization rate (64% vs. 73%, p=0.02), clinical pregnancy rate (13% vs. 47%, p<0.001) and good embryo quality rates (35% vs 56%, p=0.009) were observed in patients with non-obstructive azoospermia. In patients with obstructive azoospermia no significant differences were observed when the outcome was analyzed based on the sperm origin, from TESE or MESA in conclusion, when combining TESEor MESA with ICSI in patients with obstructive azoospermia, the results in terms of fertilization, implantation and pregnancy rates are similar to those found in non-azoospermic patients that have undergone ICSI with ejaculated sperm. Non-obstructive azoospermia cases present lower fertilization, embryo quality and pregnancy rate than obstructive azoospermia, probably due to severe defects in spermatogenesis leading to poor gamete quality.
Key words: Azoospermia obstructive, non-obstructive, testis sperm, ICSI
Introdução
Azoospermia está presente em 5% de todos os casais investigados por infertilidade (Irvine, 1998), e em 10-20% de homens inférteis com análise do fluido seminal anormal (Stanwell-Smith & Hendry, 1984).
Com o desenvolvimento da injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI), o tratamento do fator masculino tem sido revolucionado (Palermo et al, 1992). Esta técnica tem permitido até mesmo pacientes azoospérmicos conseguirem paternidade genética, com uso de espermatozóides recuperados dos testículos ou epidídimos. Técnica de recuperação de espermatozóide epididimário incluem cirurgia aberta por aspiração microepidídimica de espermatozóides (microepididymal sperm aspiration - MESA) e um método menos invasivo, a aspiração percutânea de espermatozóides (percutaneous sperm aspiration - PESA). Espermatozóide testicular pode ser recuperado por biópsia testicular, extração de espermatozóide testicular (testicular sperm extraction - TESE), o qual é um método invasivo, ou por um método menos invasivo usando aspiração percutânea com agulha fina, aspiração testicular de espermatozóide (testicular sperm aspiration - TESA) (Silber et al., 1990; Craft et al., 1993; Van Steirteghem et al., 1998).
Tradicionalmente, a azoospermia é dividida em causas obstrutivas e não-obstrutivas. Em ambas entidades é usualmente possível recuperar espermatozóides para realizar ICSI, com uma maior probabilidade nos casos obstrutivos. No entanto, resultados não parecem comparáveis. Têm sido relatado que a taxa de fertilização e de gravidez são significativamente menores em casos de azoospermia nãoobstrutiva (Van Steirteghem et al., 1998). Outros estudos tem observado menor taxa de fertilização que não afetam o resultado em gravidez quando comparando azoospermia nãoobstrutiva e obstrutiva (Kahraman et al., 1996; Fahmy et al., 1997).
Este estudo retrospectivo relata o resultado de 83 ciclos de ICSI consecutivos realizados em 44 casais nos quais o diagnóstico.principal da infertilidade era azoospennia de ambas origens, ob.strutiva e não-obstrutiva. Achados nesses dois grupos em tennos de fertilização, implantação e gravidez são comparados.
Material e Métodos
Pacientes e ciclos
Oitenta e três ciclos de ICSI foram realizados com espennatozóides recuperados do epidídimo ou testículo, sessenta casos envolveram azoospennia obstrutiva e 23 casos de azoospennia não-obstrutiva. Os quarenta e quatro homens tinham idade de 43.2± 10.7 anos (faixa 28 a 67) com azoospennia obstrutiva (n=32) e não-obstrutiva (n= 12) foram incluídos neste estudo. Pacientes com azoospennia obstrutiva foram avaliados para mutações para tibrose cística ao passo que os indivíduos com azoospennia não-obstrutiva eram examinados com o cariótipo de sangue periférico, como apropriado. Doze mulheres tinham disfunção ovulatória ou diminuição da reserva ovariana (27%), 2 com obstrução tubária (5%), 2 tinham fator cervical (5%), e uma portadora de endometriose (2%). As 27 restantes (61 %) apresentavam função reprodutiva nonnal na avaliação para infertilidade.
Esses ciclos resultaram em 76 transferências embrionárias. Sessenta e nove transferências foram realizadas à fresco, de TESE e MESA, enquanto transferências de embriões criopreservados-descongelados foram realizados em 7 casos, 3 de TESE e 4 de MESA. Em 9 ciclos, ICSI foi realizada através de microinjeção de oócitos doados, com espennatozóides que foram obtidos do epidídimo (n= 1) ou do testículo (n=8).
Estimulação ovariana, aspiração folicular e transferência embrionária
Todas os ciclos das pacientes foram estimuladas com a combinação de agonista do GnRH e gonadotrofinas, como previamente descrito (Toner et al., 1991; Oehninger et al., 1995). O procedimento de ICSI foi realizado somente em oacitos em metáfase II (Toner et al., 1991; Palenno et al., 1999; Veeck, 1986; Mercan et al., 1998). Embriões foram transferidos transcervicalmente 3 dias após aspiração oocitária. O número de embriões transferidos dependeu do número total de embriões disponíveis, da qualidade dos embriões e da idade das mulheres. Suporte lúteo, preparação endometrial das recipientes de oócitos doados e transferência de embriões criopreservados foram descritos em detalhes em publicações prévias (Toner et al., 1991; Veeck, 1991).
Recuperação de espennatozóide do testículo e epidídimo Nos casos de azoospermia obstrutiva a recuperação de espennatozóide, em 6% dos casos, foi realizada no dia da recuperação oocihlria e em 94% dos casos no dia anterior. Nos casos de azoospermia não-obstrutiva a recuperação de espennatozóides foi realizada no dia (98% dos casos) ou dois dias (2% dos casos) antes da recuperação oocitária.
Extração de espennatozóide testicular (TESE) foi realizada de duas formas: por biópsia cirúrgica aberta ou percutâneamente usando uma pistola de biópsia de próstata. MESA foi empregada de duas maneiras, técnica aberta prévia à epidídimovasostomia, ou percutâneamente em casos de ausência congênita do duto deferente. Já PESA foi realizada através da aspiração percutânea contínua até que tluido era obtido.
Preparação de espennatozóides para ICSI e criopreservação
As amostras de tecido da biópsia testicular foram coletadas em tubos Falcon estéreis contendo 5 mL do meio de preparação de espennatozóides (Irvine Scientific, Santa Ana, CA). As amostras de tecido eram colocadas em placa plana e dilacerados com lâminas estéreis de microscópio ou agulhas tuberculinas. Após os espennatozóides serem identificados, a suspensão celular era colocada em tubos Falcon 15 mL e uma igual quantidade de Erythrocyte Lysing Buffer (ELB) era adicionada, e esta solução era centrifugada a 1500 rpm por 5 minutos. Os pellets eram então lavados com meio de preparação de espennatozóide e centrifugados como indicado acima; este processo era repetido se o pellet contivesse um alto número de hemácias, indicado por aparência hemática. Os pellets eram ressuspensos com 20-75 µl de meio de cultura, e incubados a 37°C, 5% CO2 no ar até recuperação oocitária.
Aspirados do epidfdimo foram diluídos I: 1 com meio de lavar espennatozóide e centrifugado por 10 minutos a 427 x g. O pellet era ressuspenso em 0.5 mL de meio de lavar espennatozóide. A amostra era centrifugada por 10 minutos a 427 x g, e o sobrenadante era removido. Se tivesse uma contagem extremamente baixa, 0.05 a 0. 1 mL de meio de lavar espennatozóides era adicionada ao pellet e ressuspenso. Se contagem e motilidade eram mais altos, o pellet era superposto com 0. 1 mL de meio de lavar espennatozóide, tampa frouxa, e incubado a 37°C, 5% CO2 no ar até que os oócitos estivessem disponíveis.
Detalhes do holding e micropipetas de injeção de oacitos e equipamentos de micromanipulação (micromanipulador Narishige -Narishige, US, Inc. Greenvale, NY, EUA) usado em conjunto com um microscópio com placa aquecida em um microscópio invertido (Nikon - Nikon Inc., Garden City, NY, EUA) usado para ICSI foi previamente descrito (Oehninger et al., 1995). A técnica de ICSI utilizada foi anterionnente publicada (Mercan et al., 1998). Oócitos injetados foram lavados em meio fresco e incubados de fonna padrão até a avaliação para fertilização (Oehninger et al., 1995).
Espennatozóides epididimário eram criopreservados após centrifugação a 360 x g por 10 minutos usando human tubal tluid (HTF) contendo 0.3% albumina sérica humana (HSA) (HTF + 0.3% HSA, Irvine Scientific). Cada pellet era ressuspenso em HTF + 0. 3% HSA fresco e misturado gentilmente com meio de congelamento (Irvine Scientific) de forma gotejada até que um 1 : razão de volume de espennatozóide lavado para meio de congelamento era obtido em 10 minutos. A mistura era então resfrràda a 4ºC durante sessenta minutos e posterionnente colocada a 5 cm do nível superior do nitrogênio líquido por 20 minutos. Finalmente era imersa em nitrogênio líquido. Tecido testicular era dilacerado gentilmente usando uma lâmina microscópica estéril e as partículas de tecido/fluido eram removidas usando pipeta de transferência com ponta estreita. Misturas com mais de 400 µl em volume eram centrifugadas a 280 x g for 5 minutos seguido por remoção do sobrenadante para ajustar o volume. Os pedaços maiores de tecido eram também transferidos para um outro frasco de congelamento rotulado para criopreservação. Espermatozóides/tecido testicular eram então criopreservados como indicado para espermatozóide epididimário. Amostras eram descongeladas em banho-mariaa 37-40 °C por 3-4 minutos e processadas para ICSI.
Análise estatística
A taxa de fertilização foi definida como o número total de embriões em pró-núcleo (dois pró-núcleos) observados no dia após a ICSI divididos pelo número total de oócitos maduros microinjetados. Embrião de boa qualidade foi considerado como o número de embriões de grau 1 e 2 (Veeck, 1986) divididos pelo número total de embriões transferidos. Embriões com graus 1 e 2 representavam a melhor morfologia (num sistema de graduação de 1-5) como verificado conforme o critério de Veeck (Veeck, 1986; Veeck, 1991). A taxa de implantação foi calculada como o número de sacos gestacionais visibilizados através da ultra-sonografia divididos pelo número total de embriões transferidos. Gestação clínica foi definida como a presença de saco(s) gestacional(is) por ultra-sonografia com 6-7 semanas. de gestação. Todos resultados são expressados como média ± desvio padrão. T-teste estudante e teste de chi-quadrado foram usados conforme apropriado. Valores P <0.05 eram considerados significativos.
Resultados
A idade dos pac ientes do sexo mascu lino foram significativamente maior nos casos de azoospermia obstrutiva quando comparado com não-obstrutiva (45.6± 11 .5 anos vs. 38.6±6.2 anos, respectivamente, p=0.01). A média de idade das mulheres foi 36±5 e 34±7, respectivamente, sem diferença significativa. Não existia diferenças em relação à duração da infertilidade e a distribuição das várias categorias etiológicas femininas entre os grupos.
Entre casos com insuficiência testicular, tinha um paciente com síndrome de Sertoli isolada; os 8 pacientes restantes sofriam de falência testicular primária associada com hipoespermatogênese ou parada da maturação. Um paciente tinha síndrome de Klinefelter. Três casos de azoospermia secundária devido à doença oncológica que incluía 2 pacientes com carcinoma testicular, e 1 paciente com carcinoma de intestino, cada recebeu tratamento com radioterapia e quimioterapia. Das três gestações adquiridas no grupo de azoospermia não-obstrutiva, o único parto correspondeu ao paciente da síndrome de células Sertoli isolada.
Cinqüenta e quatro biópsias testiculares (TESE) e 18 aspirações epididimárias (MESA) foram realizadas. Em seis pacientes, TESE foi realizada seguindo um ciclo anterior sem sucesso após MESA (sem espermatozóide); em 4 desses pacientes, essa abordagem resultou em recuperação de espermatozóides móveis mas nos 2 restantes nenhum espermatozóides pode ser recuperado. Ao todo, em quatro pacientes (5.5%), espermatozóides não pôde ser recuperados mesmo após múltiplas biópsias abertas testiculares. Um deles era um paciente com azoospermia obstrutiva devido à um processo inflamatório epididimário, e outros três tinham azoospermia não-obstrutiva (parada da maturação).
Espermatozóides móveis foram recuperados em 65 casos (90.3%). Em 3 outros casos (4.2%), espermatozóides imóveis foram observados. Um era um paciente com 62 anos de idade com vasectomia realizada 12 anos antes, um tinha azoospermia não-obstrutiva devido à síndrome de Klinefelter e um tinha se submetido à tratamento para câncer com radioterapia. Exceto o paciente com câncer onde teve falência da fertilização, 4 embriões foram transferidos em cada, dos outros 2 casos com espermatozóides imóveis, embora nenhuma gravidez foi conseguida. Em II casos, espermatozóides congelados de um procedimento prévio foi utilizado, (3 TESE e 8 MESA), 7 ciclos foram realizados em pacientes com azoospermia obstrutiva e 4 ciclos em pacientes com não-obstrutiva. Em todos esses casos ICSI foi realizadacom espermatozóide móvel. A taxade embriões de boa qualidade dos embriões transferidos foi 59%. Em um caso de azoospermia obstrutiva e em um outro de azoospermia não-obstrutiva, ocorreu completa falha na fertilização. Tiveram cinco gestações nestes ciclos: uma gestação bioquímica num caso de azoospermia não-obstrutiva no qual espermatozóides foram congelados após o procedimento de TESE, e 4 dos pacientes com azoospermia obstrutiva. Uma gestação gemei ar terminou em abortamento espontâneo no primeiro trimestre, e as 3 restantes foram gestações únicas que evoluíram para o parto. Todas essas gestações foram conseguidas após ICSI usando espermatozóide congelado após o procedimento de MESA.
No total, o número médio de oócitos maduros microinjetados foi 10.2±5.0 número médio de oócitos fertilizados foi 7.2±4.4. O número médio de embriões transferidos por ciclo foi 3.4± 1 .6. Em 3 casos (4.8%) ocorreu completa falha na fertilização, e em 4 casos (5.5%) espermatozóides não foram recuperados. Assim, houve um total de 76 transferências; 69 usando embriões frescos e 7 usando criopreservados.
A taxa de fertilização normal foi significativamente mais baixa (64% vs. 73%, p=0.02), taxa de gestação clínica (13% vs. 47%, p<0.0001) .e taxa de embrião de boa qualidade (35% vs. 56%, p=0.009) foram observados em pacientes com azoospermia não-obstrutiva quando comparado com aqueles com azoospermia obstrutiva. Taxa de implantação e abortamento não mostraram diferenças significativas entre os dois grupos. Em 7 ciclos de embriões criopreservados-descongelados foram transferidos, 29% deles com embrião de boa qualidade. Nenhuma gravidez foi obtida nesses ciclos.
Resultado do grupo de pacientes com azoospermia obstrutiva foi posteriormente analisados baseados na origem do espermatozóide, de TESE vs. MESA. Não houve diferença significativa nas taxas de fertilização, embrião de boa qualidade, fertilização anormal, implantação, gravidez e abortamento.
Discussão
Neste estudo retrospectivo, taxa de fertilização significativamente maior, assim como embrião de boa qualidade e taxa de gravidez foram observadas em casos de azoospermia obstrutiva comparado com não-obstrutiva. Além disso, a taxa de fertilização anormal foi maior na azoospermia não-obstrutiva que na obstrutiva. No entanto, nenhuma diferença significativa foi encontrada, mas sim uma tendência à um aumento na taxa de implantação em azoospermia obstrutiva comparado com não-obstrutiva foi notado (12% vs. 5%, respectivamente).
A média de idade em paciente homens foi significativamente maior naqueles com azoospermia obstrutiva. Isso pode se dever ao fato da maioria deles ter adquirido uma obstrução após uma vasectomia. Isto é provavelmente a razão pela qual esses casais tinham em média 6 anos de infertilidade.
A taxa de fertilização observada após ICSI em casos de azoospermia obstrutiva (73%) e em casos de azoospermia nãoobstrutiva (64%) foi levemente maior que os relatos publicados ((Tournaye et al., 1996). Kahraman et al. (1996) observaram taxa de fertilização de 40% em azoospermia não-obstrutiva e 65% em azoosperm ia obstrutiva. Esses achados são similares aos reportados por Fahmy et al. (1997), taxa de fertilização de 58% e 41 % em azoospermia obstrutiva e não-obstrutiva, respectivamente. De Croo et al. observaram taxa de fertilização similar aos nossos resultados (74.5% em azoospermia obstrutiva e 67.8% em azoospermia não-obstrutiva). Esses autores também acharam qualidade embrionária similar, assim como taxas de implantação e gravidez similares entre os grupos obstrutiva e não-obstrutiva. O presente estudo, como outros (Silber et al., 1990; Oehninger et al., 1995; Mansour et al., 1997), notou uma taxa de gravidez significativamente mais baixa em casos de azoospermia não-obstrutiva comparado com azoospermia obstrutiva.
Embora a ativação genética paterna não é observada até o estágio celular de 4 células em embriões humanos (Braude et al., 1988), evidências tem sido fornecidas para um importante efeito paterno no desenvolvimento embrionário humano préimplantacional. Comparando a formação de blastocisto em ciclos de FIV real izados com espermatozóides normais, espermatozóide de doadores ou de homens com oligozoospermia acentuada, essa formação foi acentuadamente reduzida quando inseminado oócitos com espermatozóides de pacientes oligospérmicos (Janny & Menezo, 1994).
Atraso na fertilização e pobre desenvolvimento embrionário foram associados com qualidade do sêmen seguindo FIV (Oehninger et al., 1989; Ron-El et al., 1991). Em estágio precoce do desenvolvimento embriomirio uma associação entre morfologia anormal dos espermatozóides e pobre morfologia embrionária tem sido mostrado (Parinaud et al., 1993).
Num estudo prévio (Oehninger et al., 1998) usando ciclos de doação de oócito como modelo de controle de qualidade dos oócitos, concluíram que homens com ruins parâmetros espenmiticos não contribuíram para um desenvolvimento embrionário desfavorável em ICSI. Pacientes inférteis com oligoastenozoospermia levou a embriões com implantação e potencial de desenvolvimento similares a aqueles pacientes inférteis e férteis com normozoospermia. No entanto, foi demonstrado uma tendência à uma menor taxa de fertilização em pacientes com comprometimento importante dos parâmetros da análise seminal básica após ICSI assim como qualidade embrionária in ferior (baseado em critérios de clivagem e morfologia) (Hsu et al., 1999).
No presente estudo, foi observado resultados similares no grupo de azoospermia obstrutiva à aqueles encontrados em 532 casos de ICSI usando espermatozóide ejaculado realizado nesse programa nesse mesmo período: 72% taxa de fertilização normal, 35% taxa de gravidez, e 13% taxa de implantação (dados não publicados). Além disso, observamos não haver diferença em fertil ização ou resultado de gravidez relacionado com espermatozóides recuperados pelas técnicas de TESE ou MESA.
Uma explosão de métodos para obter espermatozóides tem acompanhado o sucesso com ICSI com espermatozóides cirurgicamente recuperados. Recentemente, Tournaye (1999) concluiu que a aspiração percutânea dos testículos pode ser o método de escolha em pacientes com espermatogênese normal, devido à alta taxa de recuperação de espermatozóides e menor dor experimentados pelos pacientes. Em pacientes com azoospermia obstrutiva com investigação incompleta, MESA é o método preferido, considerando que uma completa exploração escrotal poderá ser realizada e, se indicada, uma epidídimovasostomia pode ser realizada concomitantemente. Em pacientes azoospérmicos não-obstrutivo, recuperação cirúrgica de espermatozóides testiculares através de biópsias (múltiplas) abertas com criopreservação pode ser o método de escolha pelo qual previne repetidas cirurgias e uma estimulação ovariana adicional à parceira (Tournaye, 1999).
Pode ser concluído desse estudo que ICSI em combinação com TESE ou MESA em pacientes com azoospermia obstrutiva, resulta em termos de fertilização, implantação e gravidez, em taxas similares à aqueles observados em pacientes não-azoospérmicos que são submetidos à ICSI. Ao invés, nos casos de azoospermia não-obstrutiva, taxa de fertilização mais baixa, qualidade embrionária e gestação foram notadas, talvez devido à defeitos graves na espermatogênese levando à baixa qualidade dos gametas. Esforços necessitam de ser continuados no sentido da identificação de de feitos cromossômico/genético em tais casos sendo então um apropriado aconselhamento genético indicado.
Irvine D.S.- Epidemiology and etiology of male infertility. Hum. Reprod., 13(Suppl): 33-34, 1998.