JBRA Assist. Reprod. 2001;05(03):114-120
ATUALIZAÇÃO
doi: 10.5935/1518-0557.2001.5.3.06
Entendendo o processo de fertilização ... (da retomada da meiose até a formação da primeira célula embrionária) Parte II
Understanding the fertilization process ... Part 2
Resumo
Entender as bases biológicas e molecul ares da fertilização parece ser crucial para a compreensão de eventuais disfunções na capacidade de reproduzir-se. Considerando que as técnicas de reprodução assistida (como fertilização "in vitro" clássica e ICSI) têm se tornado rotina para o tratamento de casais infértei s, sendo possível solucionar problemas críticos durante o processo de fertilização. Esta revisão teve por objetivo relatar alguns dos principais eventos que acontecem desde a fusão das membranas plasmáticas dos gametas até a formação da primeira célula (zigoto) e sua relevância para a medicina reprodutiva. Aspectos como prováveis causas de falhas de fertilização e/ou ferti li zação anormal, participação dos centríolos e mitocôndrias na formação embrionária foram aspectos também abordados.
Unitermos: Fertilização, falha de fertilização, singamia, centríolos, mitocôndrias.
Abstract
Understanding the molecular and cell biology basis of fertilization is central in creating a complete body of knowledge regarding normal and abnonnal reproduction. Considering that ART (as "in vitro" fertilization and ICSI) have been became routine to infertility treatment, many problems can be solved in terms of fertilization processo This review focused main events since gametes plasm membrane fusion until first diploid cell formation (zygote) and its clinical relevance. Some aspects according to fertilization failures or abnormalities, role of centrioli and mitochondria during embryo development were also related.
Key words: fertilization, fertilization failure, singamy, centrioli, mitochondria.
Introdução
A fertilização é um processo que culmina com a união de um (e somente um) prónucleo de um espennatozóide com o prónucleo de um oócito dentro de um ooplasma ativado, logo depois da liberação do corpúsculo polar (Nielssen, 2001). Para que isto ocorra com sucesso, vários eventos devem ocorrer. Como já foi visto, a fase quatro da fertilização caracteriza-se pela fusão das membranas plasmáticas do espermatozóide e do oócito através de um estreito contato entre a membrana acrosomal interna do espermatozóide e o oolema. A incorporação física do espermatozóide para o interior do oócito ocorre simultaneamente com a ativação oocitária e com a reação cortical (extrusão dos grânulos localizados na córtex oocitária, visando um afastamento entre a membrana plasmática e a zona pelúcida, com preenchimento do espaço perivitelino por uma substância hialina). Em humanos, o espermatozó ide "descansa" tangencialmente na superfície oocitária e depois entra. Acredita-se que haja a intensa participação de microfilamentos oocitários, auxiliando a entrada do espennatozóide com a fonnação de um "cone protéico de incorporação". Até então, o oócito era uma célula metabolicamente quiescente! A união entre o espennatozóide e o oolema com conseqüente fusão de membranas, inicia uma cascata de eventos localizados na membrana plasmática - evitando a entrada de outros espennatozóides (bloqueio rápido e lento à polispennia) - como também ao nível citoplasmático, iniciando o processo de ati vação oocitária (cálcio dependente).(Rossi-Ferragut et al., 2001). Uma vez ocorrida a fusão espennatozóide-oócito, ocorre também uma repentina redução na motilidade do espennatozóide devido ao influxo de cálcio e/ou despolarização da membrana plasmática que se inicia no flagelo (Yanagimachi, 1978; Jaffe, 1990).
As mitocôndrias localizadas na peça intennediária também entram e seu destino ainda pennanece obscuro (Blerkon, 2001).
Fase 5 - Término da meiose
Caracteriza-se aqui a etapa de ativação oocitária e a teoria mais aceita é aquela que sugere que o espermatozóide libere, logo após a entrada no ooplasma, frações protéicas de alto peso molecular estimulando o oócito (Firuza et al, 1997). Como já se sabe, o gameta que permite a fertilização pelo espermatozóide deve necessariamente estar em metáfase II (ln, 2c). Assim, após a entrada do espermatozóide para o interior do ooplasma, o oócito "entende" que deve prosseguir na meiose e liberar outro pacote de cromátides (corpúsculo polar - lc). A parada em metáfase II deve-se à presença de fatores citostáticos, que envolvem a participação de substâncias codificadas pelos genes c-mos assim como proteínas ativadoras da cascata da proteína kinase (MAP - mitogen-activating protein). De uma maneira geral, em todas as células eucariontes, o ciclo de divisão celular é programado por duas proteínas: a proteína kinase cdc2 e a ciclina (Deng & Shen, 2000). Durante a fase G I, a ciclina é sintetizada e se liga a cdc2 para formar o complexo cdc2-ciclina ou MPF (fator promotor de metáfase). Com a elevação do cálcio intracelular decorrente da incorporação do espermatozóide, alguns fatores citostáticos (CSF) são biodegradados, permitindo uma modulação dos canais iônicos da membrana plasmática e a inativação do MPF. Nos oocitos dentro dos ovários, a concentração de MPF aumenta após a quebra da vesícula germinativa. Depois disso, desaparece temporariamente durante a primeira divisão meiótica e aumenta novamente quando os oocitos entram na segunda divisão meiótica, permanecendo em metáfase II por muito tempo, provavelmente devido ao CSF que estabiliza o MPF, agindo direta ou indiretamente sobre os microtúbulos. A inativação do CSF - através de mecanismos independentes - causa degradação do MPF permitindo que o zigoto saia da fase de metáfase II, completando o processo e liberando outro corpúsculo polar (Hashimoto & Kishimoto, 1988; Masui, 1991; Watanabe et al., 1991; Weber et al., 1991; Levasseur & McDougall, 2000). Encontra-se então, ativado e rearranja seu conteúdo genético estruturando o prónucleo feminino em posição excêntrica. Percebe-se, pois, que a meiose só termina caso aconteça a fecundação do oócito por um gameta masculino.
Fase 6 - Formação do prónucleo masculino
O primeiro evento em relação ao espermatozóide, que ocorre no ooplasma é a quebra do envoltório nuclear, através de um mecanismo ainda não muito bem elucidado. Em processos normais de fertilização, o núcleo do espermatozóide se descondensa durante a ativação oocitária. Isto mobiliza uma cascata bioquímica controlada pela tirosina kinase e propicia a quebra do envoltório nuclear, permitindo, que divisões celulares possam ocorrer. Para que o prónucleo masculino possa ser formado a partir do núcleo masculino é condição sine qua non a ocorrência da ativação oocitária. Enquanto a cabeça do espermatozóide se descondensa, a região centriolar forma o "áster" (conjunto de microtúbulos que sairão do prónucleo masculino a fim de guiar e tracionar o prónucleo feminino). O centrossoma possui proteínas de regulação para cálcio (centrina e pericentrina) e desempenha um papel importante na divisão celular e nuclear (Firuza, 1997).
Fase 7 - Aproximação dos prónucleos
Após o término da meiose, o prónucleo feminino apesar de ser excêntrico, está mais próximo do centro da célula quando comparado ao masculino que está situado na região cortical, próximo ao seu sítio de penetração. Antes da fusão, estas duas estruturas devem migrar uma distância considerável através do citoplasma. Neste estágio, os cromossomos paternos e matemos, apesar de estarem na mesma célula, estão fisicamente separados. Mais tarde migrarão para o centro da célula (placa metafásica) onde então ocorrerá a fusão. Na espécie humana, o espermatozóide é o principal responsável pela aproximação entre os dois prónucleos. Este movimento parece ser mediado pelo áster através de um complexo sistema de longos microtúbulos que partem dos centríolos (que após a entrada no oócito, sofrem duplicação) e interagem com a região organizadora de microtúbulos (MTOC). Durante a migração, os microtúbulos do áster se estendem (através da polimerização proteica) até a proximidade do prónucleo feminino onde se ligam. Uma vez conectados ao prónucleo feminino, sofrem despolimerização e "puxam" esta estrutura para perto do prónucleo masculino, na região da placa metafásica do oócito, (figura 1) tornando-se altamente próximos, onde permanecem até a quebra do envelope nuclear e posterior mistura do material genético paterno e matemo.
Figura 1. Fotomicrografia obtida por contraste de fase, de um mesmo oócito, em tempos diferentes, mostrando a aproximação entre os prónucleos feminino e masculino. A seta↑indica o prónucleo masculino rodeado pelas fibras do áster e o (*) indica o prónucleo feminino que será "puxado" para o centro do oócito. (Browder et al., 1991).
Fase 8 - Singamia
Ocorre então a quebra e fusão dos envoltórios que revestem os prónucleos por um processo denominado singamia, com grande participação do citoesqueleto para a manutenção do fuso de divisão (spindle) e determinação do eixo de divisão celular (Browder et al., 1991). A singamia começa com uma intensa interdigitação entre os envoltórios nucleares dos dois prónucleos. À medida que o processo progride, um complexo sistema integrador é formado entre as duas membranas nucleares, simultaneamente à formação de vacúolos e do fuso de divisão celular. As membranas se fundem em vários pontos e ocorre a mistura do material genético. Novamente, neste evento, parece haver a participação direta dos íons cálcio, sendo então formado o primeiro aparato cromossômico do novo indivíduo.
Fase 9 - Formação da primeira célula do novo indivíduo (zigoto)
Após este exaustivo processo, tinalmente a primeira célula do indivíduo está formada e possui todas as informações genéticas e moleculares para a formação do novo ser, altamente diferenciado, constituído por trilhões de células diferentes. Neste momento, como já foi mencionado, o número diplóide da espécie é restabelecido assim como a determinação do sexo cromossômico.
Fase 10- Clivagem
Uma outra conseqüência da fecundação relaciona-se à capacidade exibida pelo pré-embrião, em iniciar um processo singular somente desempenhado por ele, chamado clivagem.
Comentários:
Origem paterna do centríolo
Fertilização em humanos é um processo que termina quando o material genético dos prónucleos (feminino e masculino) se mistura dentro de um oócito ativado. Para que isto ocorra com sucesso, uma série de eventos complexos deve acontecer. Em sendo assim, eventuais falhas durante este exaustivo percurso podem prejudicar, em muito, o desenvolvimento do zigoto e por vezes, explicar alguns tipos de infertilidade sem diagnóstico. Sem dúvida, o papel dos microtúbulos em relação aos arranjos estruturais e de motilidade dentro do ambiente oocitário durante a união dos prónucleos e primeiras divisões celulares, é vital. Seguindo-se à incorporação do espermatozóide no oócito, a ativação oocitária e a coincidente formação dos prónucleos, um novo sistema de movimentação forma-se dentro do ooplasma e sua organização depende do centríolo do espermatozóide. Assim, enquanto o espermatozóide fornece o centro ativo de divisão, o oócito fornece todos os outros elementos necessários para o desenvolvimento do embrião (Sathanantham et al., 1996). Estas organelas são estruturadas durante a gametogênese. Durante a espermatogênese, as células germinativas possuem um centrosoma, constituído por dois centríolos (um proximal e outro distal) alinhados em ângulos retos envolvidos por material pericentriolar. Na fase de espermiogênese, o centríolo distal se localiza paralelamente ao maior eixo da célula e permite a conexão com microtúbulos formando o flagelo e conseqüentemente o motor do espermatozóide (axonema). Também auxilia na conexão com a peça intermediária e depois se perde, indicando que não está relacionado ao sistema de divisão celular. Já o centríolo proximal, permanece no citoplasma perinuclear, entre a cabeça e a peça intermediária (em uma região chamada black-box) e exibe relação direta com a aproximação dos prónucleos e formação do eixo de clivagem embrionária. Também chamado de centrosoma funcional do espermatozóide, o centríolo proximal se duplica durante a fertilização e clivagem e organiza o aparato de divisão celular até a perda da zona pelúcida. Esta organela é, portanto, de origem paterna em humanos e é a responsável pela ocorrência da clivagem. Raciocinando sob este prisma, como ficaria então a questão da partenogênese? Acredita-se que o centríolo oocitário é in ativo, mas que existam substâncias (centrosomalike) capazes de organizar alguns poucos filamentos protéicos e permitir que a clivagem aconteça até fases muito precoces (no máximo oito células).
Se o espermatozóide entra inteiro no ooplasma, como explicar a origem mitocondrial materna?
Durante a espermiogênese, as mitocôndrias da espermátide migram para a região que dará origem à peça intermediária do espermatozóide. Durante a fertilização in vivo, "in vitro" e principalmente na ICSI as mitocôndrias paternas são depositadas no ooplasma, juntamente com centríolos e DNA. Sendo assim, se o espermatozóide entra inteiro no ooplasma, como explicar a origem mitocondrial materna? Quatro teorias têm tentado explicar o "desaparecimento" do DNA mitocondrial (DNA mt) paterno, reforçando a idéia da origem materna das mitocôndrias, sem heteroplasmia. O primeiro seria a degeneração mitocondrial do espermatozóide devido ao estresse oxidativo decorrente da árdua caminhada até o oócito e da penetração em seu interior (quando a fertilização ocorre in vivo); a segunda compara quantitativamente o DNA mt paterno e materno e, sugere que, tendo em vista a pequena quantidade de DNA mt paterno, este seria incapaz de se expressar no ambiente oocitário; a terceira salienta um mecanismo de inativação do DNA mt paterno que ocorreria dentro do ooplasma desencadeado por moléculas específicas do oócito localizadas no citoplasma. Estas moléculas seriam capazes de reconhecer e inativar o DNA mt paterno somente. A última especulação refere-se à possibilidade de que o DNA mt paterno seria conduzido para as células do trofoblasto e posteriormente para placenta, não fazendo parte do embrião propriamente dito (Blerkon, 2001; ESHRE 2001).
Qualidade do espermatozóide: o que de fato importa?
Após a introdução da injeção intracitoplasmática de espermatozóide (Palermo et al., 1992) a função do espermatozóide durante o processo de fertilização ficou limitada à deposição do centríolo e do material genético para o interior do ooplasma. Em relação a esta restrita função espermática na ICSI, a análise seminal de rotina pode ser considerada obsoleta. Isto porque a análise dos parâmetros seminais e os testes de função espermática estão designados para investigar populações de espermatozóides e não necessari amente refletem as propriedades daquele espermatozóide que será injetado pela ICSI. O número de espermatozóides não mais interfere, visto que a fertilização ocorre pela injeção de um único espermatozóide, aspirado e injetado pelo embriologista. A motilidade, assim como os testes que avaliam a capacidade de penetração do espermatozóide, parecem ser irrelevantes, pois o gameta masculino é movimentado e injetado para o interior do oócito também pelo embriologista e não por sua conta própria. No entanto, o único parâmetro que parece de fato, predizer taxas de sucesso em ICSI parece ser a morfologia estrita. Em estudos prévios, nosso grupo salientou a importância da qualidade espermática (Rossi-Ferragut, 2001b) em ICSI e a importância da morfologia estrita de Kruger (1986) em ciclos de inseminação intra-uterina (Borges Jr. et al., 2001). Aneuploidias têm sido encontradas em formas anormais de espermatozóides (Lee et al., 1996; Brandiff et al., 1990; Martin et al., 1992). Injetar, através da ICSI, espermatozóides com morfologia normal parece minimizar os riscos de fertilização anormal.
Falhas na Fertilização durante a ICSI:
Através da ICSI, as 4 primeiras etapas do processo de fertilização são ultrapassadas. Uma vez depositado no ooplasma, o espermatozóide deverá ser capaz de realizar somente, as etapas subseqüentes. Mesmo assim, a ausência total de fertilização e/ou fertilização anormal (números alterados de prónucleos e corpúsculos polares) podem ser evidenciadas. Morfologicamente, podem ser distinguidos dois grupos de falhas de fertilização: a) quando o processo parece ser independente da penetração e/ou descondensação do espermatozóide (disfunção oocitária) e b) quando vários núcleos de espermatozóides se descondensam formando prónucleos adicionais, sugerindo que tanto o gameta masculino, quer seja o espermatozóide ou as células da linhagem germinativa (no caso de injeção de espermátides) quanto o oócito exercem importantes papéis no processo de fertilização (Oskowitz et al., 1995). Em relação à hiperploidia, quatro situações podem ser elucidadas, na ICSI, conforme mostra o esquema I.
Esquema I. Prováveis causas defertilização anormal em ICSI
Nos casos em que somente um prónucleo é observado pode ter havido a ativação oocitária independentemente da presença do espermatozóide e/ou da descondensação nuclear (partenogênese). Nos casos não-partenogenéticos normalmente o fator é oocitário (por exemplo, assincrônia na formação de prónucleos ou falha na formação do prónucleo masculino decorrente de falha da ativação oocitária) (Wan- Song et al., 1998). Diferentes níveis de descondensação do espermatozóide diretamente relacionado com o tempo de observação podem demonstrar a presença de apenas um prónucleo em um zigoto diplóide, conferindo um diagnóstico alterado.
A clivagem: processo que só ocorre no embrião
Apesar de já não fazer parte do processo de fertilização, a clivagem é resultado deste processo. Uma vez formado o zigoto, ocorre duplicação dos centríolos paternos e migração para pólos opostos da célula, que determinará o eixo de divisão celular, a exemplo dos processos clássicos como meiose e mitose. É comum falar que "o zigoto se divide por mitose e da origem ao embrião" (Nielssen, 2001). Pensando sob este aspecto, através da mitose, uma célula mãe duplica seu conteúdo cromossômico e dá origem a duas células filhas exatamente iguais àquela de origem, como por exemplo, nos casos de cicatrização, regeneração e crescimento de órgãos ou tecidos. A clivagem é diferente, pois cada célula, mesmo em estágios muito precoces, já possui a. informação de diferenciação celular com distribuição não eqüitativa de seu conteúdo citoplasmático (chamados de determinantes morfogênicos). O esquema II elucida este processo. Apesar da diferenciação molecular de cada célula, os blastômeros, até a fase de blastocisto, são considerados totipotentes e quando retirados, poderão dar origem a um outro embrião exatamente igual, quando ainda possuem a mesma aparência e desempenham a mesma função. Esta diversidade de moléculas citoplasmáticas entre os blastômeros será evidente quando da formação das duas massas celulares distintas: uma massa celular interna que dará origem ao embrioblasto e a massa celular externa ou trofoblasto, caracterizando a fase de blastocisto.
Esquema II. O esquema II mostra que não existe uma distribuição eqüitativa dos constituintes citoplasmáticos do zigoto para os blastômeros. De acordo com a quantidade e a qualidade dos determinantes morfogênicos do citoplasma, haverá uma expressão diferenciada do material genético, diferenciando as células, apesar da totipotência.
Referências Bibliográficas
Blerkon V.J. - Epigenetic influences of mitochondria in early human development - Reproductive Genetics Pre-Congress Course on "Mitochondrial Inheritance". Lausanne, Switzerland, 2001
Jafte L. A. - First messengers at lertilization. J. Reprod. Fertil., 42: 107-11 6, 1990.