JBRA Assist. Reprod. 2001;05(03):121-124
ATUALIZAÇÃO
doi: 10.5935/1518-0557.2001.5.3.07
Transferência citoplasmática e transferência nuclear
Cytoplasmic and nuclear transfer
Resumo
Transferência citoplasmática e nuclear são novas técnicas que tem sido discutidas para casais que apresentam falhas persistentes em Fertilização Hin vitro", devido também a embriões de baixa qualidade ou por oócitos inferiores em mulheres, acima de 40 anos. Esta revisão investiga a evolução e possibilidades desses procedimentos ou métodos.
Key words: cytoplasmic transfer, nuclear transfer
Abstract
Cytoplasmic transfer and nuclear transfer are new techniques that have been discussed to couples that present persistent failures in IVF due either to bad embryos or to poor oocytes in women over 40 years old. This review look into the evolution and possibilities of those procedures.
Unitermos: transferência de citoplasma, transferência nuclear
Introdução
Durante os últimos 20 anos as técnicas de reprodução assistida se desenvolveram a patamares que antes não seria possível se imaginar, pelmitindo, por exemplo, que através da ICSI casais com infertilidade causada até mesmo por ausência de espermatozóides no ejaculado pudessem conceber. Atualmente, o diagnóstico pré-implantação, realizado através das técnicas de FISH (fluorescence hybridization in situ) e PCR (polymerase chain reaction) permite a identificação de aneuploidias e alterações gênicas nos embriões a serem transferidos. Entretanto muito há que se descobrir para solucionar problemas relacionados diretamente aos gametas, principalmente aos oócitos. O que oferecer aos casais que desenvolvem "in vitro" embriões de má qualidade somente? Que alternativa temos para mulheres com idade mais avançada? A doação de oócitos tem sido a alternativa mais frequente para estes casais. Muitos porém, a rejeitam, pois tem o desejo de transmitir à sua prole o seu próprio material genético.
Recentemente, novas tecnologias, ainda experimentais, tem sido propostas, entre elas a transferência de citoplasma e a transferência nuclear, com o objetivo de melhorar a qualidade dos oócitos, e consequentemente a qualidade dos embriões formados e a taxa de implantação. O objetivo deste trabalho é fazer uma atualização sobre a evolução e aplicabilidade destas duas técnicas.
Transferência Citoplasmática
A fertilização e o desenvolvimento embrionário são processos que envolvem a participação de componentes nucleares e citoplasmáticos. Entre os componentes citoplasmáticos que estão envolvidos nestes processos tem os: Os RNA (mensageiro, transportador e ribossomal), proteínas de origem materna e substratos e estruturas ligadas à obtenção de energia, como por exemplo as mitocôndrias. É interessante observar que a síntese de proteínas é de extrema importância para o desenvolvimento da célula. No embrião humano a ativação do material genético ocorre a partir do estágio de 8 células. Alguns estudos experimentais demonstram que a célula do embrião é capaz de sintetizar proteínas mesmo após a retirada do seu núcleo. Estes dados demonstram que durante os ciclos iniciais o metabolismo e a síntese de proteínas são processos que estão sob o controle dos "elementos" recebidos da mãe, presentes no citoplasma. Por outro lado, a obtenção de energia é um processo vital para a célula e o aparato necessário à realização deste processo também está localizado no citoplasma.
A transferência de pequenas frações de citoplasma poderia envolver a introdução de componentes citoplasmáticos benéficos que restaurariam o crescimento e a viabilidade de oócitos comprometidos. Pacientes jovens, férteis, tem doado oócitos para a realização da transferência de citoplasma em oócitos de pacientes com falhas sucessivas de implantação. Atualmente cerca de 30 crianças nasceram no mundo através desta técnica Barrit et al., 2001.
As primeiras tentativas de transferência citoplasmática em humanos foram realizadas em casais com falhas sucessivas de implantação após ciclos de fertilização assistida. Em 1997, Cohen et al. relataram o primeiro nascimento após a utilização desta técnica.
A transferência citoplasmática pode ser classificada em dois tipos: assincrônica e sincrônica. No primeiro as células envolvidas estão em diferentes estágios de desenvolvimento, como por exemplo, zigotos anormais (1 e 3 pró-núcleos) e oócitos em metáfase II. Os fatores citoplasmáticos da célula doadora quando se usa zigoto já estariam envolvidos com o desenvolvimento do futuro embrião, portanto este não seria o estágio ideal para a realização desta técnica. Entretanto Huang et al., 1999, relatam nascimento após a transferência assincrônica entre zigotos 3 PN e oócitos em estágio de metáfase II.
Na transferência sincrônica os oócitos utilizados encontramse no mesmo estágio de desenvolvimento (ambos em metáfase II). Em geral as pacientes também são estimuladas em sincronia para que a captação dos oócitos seja no mesmo dia. Lanzendorf et al., 1999, relataram gravidez através de uma variante da transferência sincrônica, utilizando oócitos previamente criopreservados, eliminando a necessidade da sincronização entre as pacientes. Considerando-se no entanto, o atual estágio do conhecimento sobre os efeitos do congelamento nos oócitos, esta variante não se mostra efetiva do ponto de vista técnico.
Inicialmente, a transferência de citoplasma era realizada através da eletrofusão entre o citoplasto (célula enucleada) e o oócito receptor. Cohen et al., 1998, realizaram 8 ciclos de transferência de citoplasma. Em 3 ciclos a técnica utilizada foi a eletrofusão e nos 5 ciclos restantes utilizou-se a injeção direta do ooplasma através da micropipeta de injeção, a mesma utilizada para ICSI. A taxa de fertilização foi significativamente maior no grupo onde a injeção direta foi realizada (63%) versus 23% na eletrofusão. Não foi observada melhora na morfologia dos embriões formados com a eletrofusão e não houve gestação neste grupo. Em contrapartida no grupo da injeção direta, houve melhora na morfologia dos embriões e duas gestações, uma das gestações resultou em aborto. Uma terceira gestação também ocorreu neste grupo, embora os embriões transferidos não tenham apresentado melhoria no aspecto morfológico. Handbook of "in vitro" fertilization, 1999.
Atualmente, a transferência citoplasmática tem sido realizada com a injeção direta. Após a imobilização e aspiração do espermatozóide, a micropipeta de injeção é inserida no oócito doador, de onde se aspira cerca de 5 a 10% do ooplasma . Em seguida realiza-se a transferência de citoplasma e a injeção intracitoplasmática simultaneamente.
Recentemente Dale. et al (2001), relataram mais um caso de nascimento de crianças (gêmeos) através de transferência de citoplasma. O casal: mulher de 32 anos, homem de 35 anos; sêmen normal, tentavam gestar há 7 anos com infertilidade idiopática. Houveram três ciclos prévios de reprodução assistida (ICSI), sempre com embriões muito fragmentados e com poucos blastômeros (4,26 ± 1,69) no dia 3 de cultura. No 4 o ciclo foi proposta a transferência de citoplasma. Dois oócitos de doadora jovem (25 anos) foram utilizados no procedimento. Dos 12 oócitos aspirados, 8 foram alocados para receber citoplasma e 4 não receberam (controle). Seis embriões se formaram neste grupo (4C, 5C, 6C, 6C, 8C, 8C ), com fragmentação variando entre 5 e 20%. No grupo controle formaram-se 3 embriões ((3C, 3C, 4C), com fragmentação entre 30 e 50%. Foram selecionados os 4 embriões mais desenvolvidos para a transferência, resultando em gestação gemelar com nascimento em setembro de 2000.
A transferência de citoplasma tem se mostrado eficiente em casos onde não há outra alternativa viável, como no relato descrito, Entretanto, não se sabe ao certo como este citoplasma "doado" melhora o desenvolvimento dos embriões. Uma das hipóteses é que, entre outros fatores, a transferência de mitocôndrias de oócitos "bons" de mulheres férteis, para oócitos "ruins", permitiria o aumento na produção de energia, capacitando o oócito receptor a produzir substâncias necessárias ao seu desenvolvimento (Van Blerkom et al., 1998). Como toda técnica experimental, alguns pontos são passíveis de crítica, como: não houve experimentação animal prévia suficiente para sedimentar as hipóteses propostas. Não há modelo experimental que permita comparação, no que diz respeito a qualidade, com os embriões humanos; e o mais polêmico de todos: a transferência de citoplasma gera na prole resultante a presença de dois tipos diferentes de DNA mitocondrial (mt DNA), o que se chama heteroplasmia.
Barritt et al., 2001 relatam pela primeira vez a confirmação de modificação genética em células de linhagem germinativa ocorrida após transferência de citoplasma. Amostras de sangue de duas crianças (9 e 14 meses) foram analisadas quanto a presença de sequências de mt DNA encontradas em mitocôndrias da doadora e receptora de citoplasma. Os resultados demonstraram que as crianças eram heteroplasmicas quanto ao mt DNA. Anteriormente, em 1999, o mesmo grupo relatou no encontro anual da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva, que a transmissão de mt DNA ocorre após transferência de citoplasma.
As mitocôndrias são as ún icas estruturas celulares encontradas no citoplasma que possuem DNA próprio. Esta característica confere às mitocôndrias a capacidade de autoduplicação, independentemente da duplicação da célula. Este fato é de extrema importância permitindo adaptação da célula à sua necessidade energética através da presença maior de mitocôndrias.
Apesar de ter sido descrita pela primeira vez em 1890, só cerca de 70 anos mais tarde (1963 ) fo idemonstrado que as mitocôndrias possuem seu próprio DNA em forma estrutural circular. Entre as funções que as mitocôndrias desempenham na célula está a produção de ATP através de reações oxidativas de substratos energéticos (macromoléculas). As reações de fosforilação oxidativa que ocorrem no interior das mitocôndrias liberam radicais que são altamente mutagênicos.
Com isso o mtDNA está muito mais vulnerável a danos do que o DNA nuclear. O risco de danos é tão alto que nenhum tipo de fosforilação oxidativa ocorre no núcleo: todas as reações deste tipo foram relegadas ao citoplasma. Consequentemente, o mtDNA necessita de um sistema de reparo bastante eficiente de modo a preservar a sua estrutura.
Se o sistema de reparo não atua de forma adequada, corrigindo os danos ocorridos, poderão persistir nas mitocôndrias mtDNA mutado juntamente com mtDNA normal. Este estado de heteroplasmia pode ser encontrado naturalmente nas células. A homoplasmia, ao contrário, seria a ocorrência isoladamente de mtDNA normal ou mutante. Segundo Poulton (1996), o nível de DNA mutante varia nos diferentes tecidos e muda com o tempo em função do metabolismo oxidativo específico de cada órgão. A proporção entre DNA,normal x DNA mutante é importante pois explicaria a origem de doenças mitocondriais. Alguns genes que anteriormente se localizavam nas mitocôndrias, durante o processo evolutivo integraram-se ao DNA nuclear. Logo, há interdependência entre eles. Com isso há também uma pressão seletiva no sentido de "baixa tolerância" à heteroplasmia. Estima-se que a heteroplasmia de genes presentes no citoplasma (mtDNA) estabeleceria uma "tensão" entre o DNA nuclear e o mtDNA, que reduziria a eficiência metabólica da célula, sendo então selecionado negativamente pelo processo de seleção natural Esta hipótese é usada para explicar, pelo menos em parte, a herança uniparental das mitocôndrias. Sabe-se que as mitocôndrias encontradas nas células são de origem materna. Assim a eliminação de um conjunto de mt DNA evita a situação de conflito entre o DNA nuclear e o mt DNA. Entretanto, os mecanismos através dos quais o mt DNA de origem paterna é eliminado ainda são obscuros. Além disso, as mitocôndrias que são transmitidas à prole através do óvulo possuem apenas uma cópia de mtDNA, ao contnirio das outras células do corpo onde as mitocôndrias possuem cerca de 7 a 10 cópias. Esta redução no número de cópias de mtDNA é um fenômeno conhecido como "bottleneck" e a consequência é que apenas uma parcela muito pequena do mtDNA materno passa para as gerações seguintes. Este fenômeno contribui também para que a heteroplasmia seja muito pouco frequente vez que mesmo a mãe apresentando heteroplasmia no seu mtDNA a chance desta heteroplasmia ser transmitida à prole é pequena.
A questão não respondida ainda é: a heteroplasmia introduzida pela transferência de citoplasma poderá causar alguma implicação para crianças nascidas por esta técnica ?
Transferência Nuclear
Apesar de todos os avanços da Reprodução Assistida, a idade da mulher continua sendo um fator determinante na obtenção de resultados. A transferência nuclear surgiu como tentativa de solucionar o problema da alta incidência de aneuploidias (30%) nos oócitos de mulheres mais velhas, vez que os elementos responsáveis pela segregação dos cromossomos encontram-se no citoplasma (fusos meióticos). Tem sido sugerido que disfunções nestes elementos levam a segregação incorreta dos cromossomos durante a meiose. Assim a transposição do núcleo de paciente mais velha para oócito enucleado de paciente jovem seria uma forma de diminuir ou evitar as aneuploidias. Para que obtenha sucesso, a técnica tem que ser realizada em oócito no estágio de vesícula germinativa (VG) pois neste estágio ainda não houve a 1a segregação dos cromossomos.
Estudos realizados em camundongos (Takeucki et al., 1999), demonstraram que a transferência de núcleo pode ser realizada sem que haja o comprometimento da maturação do oócito ou aumento na incidência de anomalias cromossômicas. Recentemente Palermo et al., 2001, relataram os primeiros resultados conseguidos após transferência nuclear em oócitos humanos. No estudo, núcleo de oócitos no estágio de vesícula germinativa (VG) foram transplantados para oócitos enucleados, também em VG. O objetivo foi avaliar a sobrevivência dos oócitos, reconstituição nuclear, maturação "in vitro", fertilização e desenvolvimento embrionário após a manipulação requerida na realização da transferência nuclear. O estudo demonstrou que os oócitos reconstituídos por transferência nuclear possuem capacidade de maturação "in vitro" e podem ser fertilizados normalmente por ICSI, embora a sobrevivência dos oócitos e a qualidade dos embriões formados não seja muito boa.
A transferência nuclear mais que a transferência citoplasmática, apresenta limitações técnicas que até o momento ainda não foram transpostas. Entre elas poderíamos destacar: número de oócitos necessários, eletrofusão e maturação "in vitro" dos oócitos reconstituídos.
Esta técnica visa favorecer principalmente pacientes mais velhas, que em geral produzem número menor de oócitos. Um maior número de oócitos se faz necessário por que em cada etapa desta técnica há perda de oócitos. Durante a enucleação oócitos podem ser danificados; na eletrofusão pode haver a ativação dos oócitos e falha de fusão entre as membranas; na maturação dos oócitos reconstituídos, apenas 60% dos oócitos mantidos em sistema de maturação chegam ao estágio de metáfase II. Assim fica evidente que quando poucos oócitos são submetidos à transferência nuclear menor é a chance obtennos oócitos reconstituidos em metáfase II.
Como a aplicação de correntes elétricas frequentemente causa ativação em oócitos humanos técnicas alternativas à eletrofusão tem sido estudadas. Tesarik et al (2000), descrevem duas novas técnicas de indução de fusão entre membranas (indução química e mecânica), para serem utilizadas na transferência nuclear. Os autores relatam que as duas técnicas levam a alta taxa de fusão entre carioplasto e citoplasto sem, entretanto, causar ativação nos oócitos. Interessante que neste estudo foram utilizados oócitos em metáfase II e não em VG, o que dispensa o sistema de "maturação in vitro" dos oócitos reconstituídos, pois eles já estão em maduros.
A tendência é que novos estudos sejam realizados e dentro de algum tempo a transferência de núcleo seja uma técnica mais simples de se realizar, a exemplo do que ocorreu com a transferência de citoplasma. Entretanto superadas as limitações técnicas restarão as questões éticas desses procedimentos.
Variação da transferência nuclear é a haploidização de células somáticas. Através da transposição do núcleo diploide de célula somática em oócito previamente enucleado em estágio de VG, com a continuidade do desenvolvimento deste oócito, resultaria, após a liberação de 1° glóbulo polar (divisão reducional) em célula (oócito) haplóide com conteúdo genético proveniente de célula somática. Teoricamente este procedimento se constituiria em fonte alternativa de oócitos. A "construção" de gametas viáveis a partir de células somáticas poderá beneficiar mulheres mais velhas, mulheres com falência ovariana precoce, más respondedoras, entre outras.
A haploidização de células somáticas assemelha-se à clonagem, mas os oócitos haplóides resultantes necessitam do gameta masculino para originar o embrião diplóide. Não se sabe se os mesmos problemas observados na clonagem como: baixa eficiência, perda precoce (embrionária e fetal) se repetiriam nesta técnica. Certo é que além das limitações inerentes à transferência nuclear propriamente dita, temos as limitações inerentes à clonagem. Muito importante se toma porém, a comprovação, através de estudos experimentais em cobaias de que estas técnicas são seguras antes que elas sejam aplicadas na prática clínica.
Poulton J. - New genetics of mitochondrial DNA diseases. Br. J. Hosp. Med., 55, 712-716, 1996.