JBRA Assist. Reprod. 2001;05(03):129-131
RELATO DE CASO
doi: 10.5935/1518-0557.2001.5.3.09
Resumo
Após a introdução do uso de co-cultura e dos meios seqüênciais, a transferência de embriões em fase de blastocisto passou a ser utilizada com freqüência, e não raramente têm-se blastocistos excedentes para congelamento. Neste relato realizamos o congelamento de 3 blastocistos usando protocolo lento com glicerol como crioprotetor. Os embriões passaram por uma solução de glicerol a 5% e outra de glicerol a 9% mais sacarose 0,2 M, antes do congelamento. Os embriões foram descongelados rapidamente e transferidos para uma solução de glicerol 5% e sacarose 0,1 M., e então passados para uma solução contendo somente sacarose 0,1 M. Depois de duas horas em meio de cultura os embriões foram transferidos para a paciente. A gravidez foi confirmada pela presença do batimento cardíaco 6 semanas após a transferência, não sendo o congelamento nesta fase uma barreira o uso de cultura prolongada.
Unitermos: fertilizacão in-vitro, congelamento, blastocisto
Abstract
The transfer of embryos at the blastocyst stage has been increasingly employed after the introduction of co-cultures and sequential media, and excess blastocysts are commonly frozen. In the present study, three blastocysts were frozen using the slow protocol with glycerol as cryoprotector. Before freezing, the embryos were passed through a 5% glycerol solution followed by 9% glycerol plus 0.2 M saccharose. The embryos were rapidly thawed and transferred to a 5% glycerol plus 0. 1 M saccharose solution, and then passed through a solution containing only 0. 1 M saccharose. After 2 h of incubation in culture medium the embryos were transferred to the patient. Pregnancy was confirmed by the presence of a heart beat 6 weeks after transfer. Therefore, embryo freezing at the blastocyst stage is not an obstacle to prolonged culture.
Key words: fertilization in-vitro, freezing, blastocyst, pregnancy
Introdução
A insatisfação com as taxas de gravidez tem feito com que muitos serviços empenhem tempo e pesquisas na tentativa de melhorá-las. Dentre as recentes conquistas merece destaque a micromanipulação de gametas e embriões, com técnicas de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) e "assited hatching" com solução química, mecânica ou com laser. Recentemente passou-se a acreditar que cultura por tempo prolongado, cinco ou seis dias, poderia favorecer a seleção embrionária, aumentando a taxa de gravidez e diminuído a probabilidade de gestação múltipla, já que menor número de embriões poderia ser transferido.
Com a introdução do uso de co-cultura e atualmente o uso dos meios seqüenciais, baseados na fisiologia do trato reprodutivo e mudanças fisiológicas do desenvolvimento do embrião, muitos autores tem adotado a cultura prolongada até o estágio de blastocisto, com êxito. Porém, o fato de termos muitas vezes blastocistos excedentes, nos tem forçado a desenvolver técnicas que possibilitem o congelamento nesta fase com probabilidade de descongelamento e gestação (Ménézo et al., 1992).
Este trabalho relata o sucesso na obtenção de gravidez após congelamento/ descongelamento de blastocisto, visando incluir dados sobre este tipo de procedimento.
Descrição do caso
A paciente MS, 32 anos com infertilidade sem causa aparente há 8 anos, tendo sido submetida a 3 tentativas de FIV anteriormente. Na primeira, apesar do sêmen estar de acordo com o padronizado pela OMS, houve falha de fertilização. Na segunda tentativa foi utilizado a ICSI, obtendo-se embriões, porém não gravidez. Na terceira tentativa tivemos sucesso com o nascimento de uma menina saudável. Três anos mais tarde retornou à clínica para tentar uma segunda gravidez. Desta vez a estimulação ovariana foi iniciada com acetato de leuprolide (Lupron; TAP Pharmaceutical, Abbot Laboratories, Chicago, U.S.A.) O, 15 ml/dia, iniciado no vigésimo primeiro dia do ciclo menstrual até o in ício da menstruação seguinte. No terceiro dia de sangramento foi iniciada a indução, com redução do Lupron para 0.05 ml/dia e a estimulação ovariana foi iniciada com hormônio folículo estimulante (Fostimon; Meizler, São Paulo) 225 UI/dia. O crescimento folicular foi monitorado somente por ultra-som endovaginal. Gonadotrofina coriônica humana (HCG, 10.000 lU, Choriomon, Meizler, São Paulo) foi administrada quando pelo menos 3 folículos com 20 mm de diâmetro foram observados. Os ovócitos foram aspirados 34-36 horas após a injeção de HCG usando punção ovariana transvaginal guiada pelo ultra-som.
Os 07 ovócitos colhidos foram lavados em D-PBS (GIBCO Laboratories, Grand Island, NY, U.S.A.), transferidos para placas contendo meio de cultura Ménézo B2 (Laboratorie CCD, Paris, França) e mantidos em incubadora (Forma modelo 31 59) a 37°C, com atmosfera contendo 5% de CO2 e umidade de 97% até a hora da fertilização. O sêmen foi preparado através de gradiente descontínuo de Percoll (55 / 90%; Pharmacia, Uppsala, Sweden). Os ovócitos foram submetidos à injeção intracitoplasmática, 3 horas após a coleta, quando estes foram desnudados com o auxílio de hialuronidase (H-3757, Sigma). A confirmação da fecundação foi verificada 18 horas após a fertilização, observando-se 07 embriões com 2 pró-núcleos (PN), sendo 03 deles depositados sobre a monocamada de células Vero cultivadas em meio de cultura Ménézo B2 com 10% de soro sintético (Irvine Scientific, USA) e 04 em meio G1 com soro albumina humana a 5% (Irvine Scientific, USA). Os embriões foram mantidos em co-cultivo até o dia 3 pós fertilização, quando sofriam troca de cerca de 70% de seu meio cultura por meio novo, sendo então mantidos até o dia 5. Os embriões colocados em meios seqüências permaneceram em placas contendo 50 µl de meio G1 cobertas com óleo mineral até o dia 3, quando eram transferidos para 50 µl de meio G2 com soro albumina humana 5%, permanecendo até o dia 5.
Dos 4 embriões que permaneceram em meio G1 /G2, 3 blastocistos foram obtidos no dia 5 e, então transferidos para a paciente. A fase lútea foi suplementada com 50 mg/IM/dia de progesterona, 16mg/dia de metit prednisolona e 80 mg/dia de ácido acetil salicílico. A paciente não engravidou, o que foi observado no resultado do ßHCG 14 dias após a transferência.
Os 3 embriões que se encontravam em cultura com células Vero estavam em fase de mórula no dia 5, foram mantidos mais um dia em estufa após troca do meio de cultura. No dia 6, os 3 embriões tornaram-se blastocistos e foram congelados. Para o congelamento, os embriões foram expostos ao crioprotetor em 2 passos: no primeiro, os embriões foram imerso em solução de glicerol a 5% em meio G2 com soro albumina humana. No segundo passo, o embrião permaneceu 10 minutos em uma solução de glicerol a 9% e sacarose 0,2 M em meio G2 com soro albumina humana 5 mg%. Em todos os passos os embriões foram processados à temperatura ambiente sob um fluxo de gás (02 5%, CO2 5% e N2 90%). Os embriões foram então passados para "paillettes" de 0,25 ml, sendo colocado um por "paillettes". A curva de congelamento usada foi : -2°C/min de 22°C a - 6°C. Foi feito o "seeding" manual depois de 30 segundos nesta temperatura. Depois o embrião foi congelado lentamente de -6 a -37°C à velocidade de - 0, 3° C/ mino Então os "paillettes" foram mergulhados diretamente no nitrogênio líquido.
Os embriões foram descongelados rapidamente, sendo mantidos à temperatura ambiente por 30 segundos e em banhomaria a 30°C por 45 segundos. O crioprotetor foi removido em 2 passos: os embriões após terem sido expel idos dos "paillettes" foram imediatamente transferidos para uma solução de glicerol 5% e sacarose 0,1 M em tampão Earle's contendo 10% de soro, permanecendo nesta solução por 5 minutos. Decorrido este tempo os embriões foram passados para uma solução contendo somente sacarose 0, 1 M em tampão Earle's, por mais 5 minutos. Os embriões ficaram ainda 5 minutos em tampão Earle's somente, quando então foram transferidos para meio Earle's onde permaneceram por 2 horas na incubadora até a transferência. A transferência foi realizada em ciclo espontâneo sem nenhum preparo endometrial prévio. A transferência ocorreu 2 hs após o descongelamento utilizandose cateter de Sydnei e sob visualização ecográfica. A fase lútea foi suplementada com 50 mg/IM de progesterona natural, 16 mg de metil prednizolona e 80 mg de ácido acetil salicilico. A gravidez foi confirmada pela presença do batimento cardíaco 6 semanas após a transferência.
Discussão
Para resolver o problema de gravidez múltiplas durante a fertilização in-vitro, o excesso de embriões pode ser congelado para transferência futura. Mas, a escolha de qual embrião deve ou não ser congelado e qual deve ser transferido é muito difícil. Demoulin et al 1991, indicam melhores taxas de gravidez com transferência de embriões criopreservados no estágio pró-nuclear. Mas nesta fase a seleção embrionária é difícil de ser feita. Pode-se estar deixando de transferir embriões bons, assim como também pode-se estar congelando embriões ruins, apesar de que alguma seleção pode ser feita através do número e polarização dos nucléolos. Em contraste, Van den Abbeel (et al., 1988). tiveram melhores taxas de gravidez com embriões congelados no estágio de clivagem, sendo mais fácil a seleção dos embriões nesta fase, através do grau de fragmentação do embrião. No entanto, 50% dos bons embriões no dia 3 tornamse blastocistos e 20% dos embriões ruins também tornaram-se blastocistos (Rijnders & Jansen, 1998).
Em animais domésticos, embriões são normalmente congelados ao est,ígio de blastocisto. Blastocistos são mais fáceis de congelar por 2 razões: o volume citoplasmático das células é menor, então a razão núcleo citoplasma é maior permitindo melhor recuperação da célula, e mesmo que algumas células tenham sido destruídas durante o procedimento de congelamento-descongelamento o número de células é maior. Alguns autores obtiveram bons resultados no congelamento de blastocistos usando protocolo lento com glicerol como crioprotetor (Ménézo et al., 1992). Entretanto, outros autores acreditam que a remoção de água da célula é limitada, pois maior desidratação, pode levar ao aumento de soluto intracelular a níveis tóxicos e vêem como protocolo alternativo a vitrificação, com o uso de maiores concentrações de crioprotetor e congelamento rápido, o que impediria a formação de gelo intracelular (Lane et al., 1999). Ambos protocolos têm dado resultados com variáveis graus de sucesso, dependendo do Serviço de fertilização in-vitro. Entretanto, faz-se necessário maiores estudos, pois o congelamento nesta fase tornou-se muito importante, devido ao aumento de adeptos a transferência neste estágio.