JBRA Assist. Reprod. 2002;06(02):55-60
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2002.6.2.02
Sobrevivência in vitro de blastocistos expandidos Mus domesticus domesticus após vitrificação
In vitro survival of Mus domesticus domesticus expanded blastocysts after vitrification
1Médica Veterinária. Mestre em Ciências Veterinárias pelo Programa de Pós-Graduação da Faculdade de Veterinária da UFRGS
2Médico Veterinário. Pesquisador CNPq. Prof. Titular do Departamento de Patologia Clínica da Faculdade de Veterinária da UFRGS
Resumo
O presente trabalho abordou aspectos da vitrificação de embriões Mus domesticus domesticus. No experimento I avaliou-se a capacidade de 138 embriões desenvolverem-se in vitro até o estádio de blastocisto eclodido após serem expostos às soluções crioprotetoras. Em quatro tratamentos os embriões foram expostos durante 2 minutos à solução de desidratação (1. 8 M EG + 6% BSA em PBSm) e transferidos para o interior das palhetas que continham a solução de vitrificação (9.0 M EG + 6% BSA em PBS). Passados 30 segundos, o conteúdo das palhetas era esvaziado em placas de Petri (AE 35 mm) que continham 3ml de PBSm, e posteriormente os embriões eram transferidos para as gotas de cultivo in vitro, onde permaneciam por 48 horas. O quinto tratamento era o controle, onde os embriões, imediatamente após a coleta, eram colocados em cultivo in vitro. As taxas de eclosão embrionária observadas nos diferentes tratamentos do experimento I foram : 75,67% (28/37) no TI; 79.41 % (27/34) no TII; 85.71 % (30/35) no TIII; 75,00% (24/32) no TIV e 94.28% (33/35) no TV (controle). O experimento II foi delineado para determinar a taxa de eclosão de 590 blastocistos expandidos submetidos à vitrificação, utilizando-se o mesmo procedimento do experimento I, com exeeção da última etapa, onde, após os 30 segundos de exposição à solução de 9,0 M de EG, as palhetas contendo os embriões eram imersas em nitrogênio líquido. As taxas de eclosão embrionária observadas nos diferentes tratamentos do experimento II foram: TI 52,41 % (76/145); TII 68,71 % (101/147); TIII 35,37% (52/ 147), TIV 58,28% (88/151) e TV 94,91 % (56/59, controle).
A sobrevivência embrionária, caracterizada pelas taxas de eclosão embrionária, permite afirmar que a exposição dos blastocistos expandidos às soluções crioprotetoras não foi prejudicial ao desenvolvimento embrionário in vitro. As palhetas de 0, 12 ml propiciam maior sobrevivência embrionária do que a observada com os embriões vitrificados em palhetas de 0,25 ml. A presença de óleo na palheta de vitrificação, independentemente do volume, foi prejudicial ao desenvolvimento embrionário in vitro de blastocistos de MuS domesticus domesticus.
Unitermos: Vitrificação, embriões, camundongo, etileno glicol, palhetas.
Abstract
This work was performed with Mus domesticus domesticus embryos and consistecl or two experiments.
The objective of the experiment I was to evaluate the toxicity of the cryoprotectors agents on embryo development. The experiment II was designed to determine the hatched blastocyst rate after vitrification using two differents procedures to loading lhe embryos into the straws. The data of the experiments were analyzecl by Qui-square Test with 5% of significance. When the test showed a significative difference among the treatments, the residues analyses were calculated. The experiment I consisted of five treatments. In four treatments, embryos were exposecl during 2 minutes to a dehydrating solution (1. 8 M EG + 6% BSA in PBSm) and then transferred to the vitrification solution (9.0 M EG + 6% BSA in PBSm). Next, embryos were loaded into straws as follows : Treatment I - 0.25 mi straw wi th air separating the three columns of vitrificalion solution; Treatment II - 0. 12 mi straw with air separation between columns; Treatment III - 0.25 ml slraw with mineral oil separation between columns; Treatment IV - 0. 12 mi straw with mineral oil separation between columns. The fifth treatment was the control, which consisted of fresh embryos cultured without being exposed to either dehydration or vitrification solutions. Thirty seconds after loading, the embryos were released from the straw in PBSm solution. The blastocyst hatched rate was 75,67% (28/37) in Treatment I; 79.41 % (27/34) in Treatment II; 85.71 % (30/35) in Treatment III; 75,00% (24/32) in Treatment IV and 94.28% (33/35) in Treatment 5 (control). No significative difference was observed among the five treatments.
Experiment II was performed under similar conditions as experiment I, except that after embryo loading into the straws (Treatments I to IV), an than they were immediately plunged into liquid nitrogen for embryo vitrification. The control treatment was also performed as in experiment I. The observed hatched blastocyst rate was 52.41 % (76/145) in Treatment I; 68.71% (101/147) in Treatment II; 35 .37% (52/ 147) in Treatment III; 58 .28% (88/151) in Treatment IV and 94.91 (56/59) in the Treatment V (control). The hatched blastocyst rate in Treatment II was significantly higher than that observed in the other vitrification treatments and was not different from the control treatment.
Based on these results it is concluded that the brief straw loading exposure of Mus domesticus domesticus expanded blastocysts to 9.0 M of EG + 6% BSA in PBS solution, with previous equilibration in 1.8 M EG + 6% BSA in PBS solution was not harmful to embryo development in vitro. The use of 0.12 mi vitrification straws gave significantly higher hatched blastocyst rate of Mus domesticus domesticus. The presence of mineral oil in the vitrification straw, independent of the volume used, was harmful to the development in vitro of embryos of Mus domesticus domesticus expanded blastocysts.
Key words: Vitrification, mouse, embryos, straws, ethylene glicol
Introdução
O estabelecimento de um método prático e eficiente de criopreservação embrionúria é ainda hoje um dos fatores chaves para o desenvolvimento e a transferência de tecnologia nas áreas da embriologia experimental e aplicada (Dobrinsky, 2002; Leibo e Songsasen, 2002). Entre os métodos utilizados, a vitrificação oferece como principal vantagem a eliminação da ocorrência de lesões celulares associadas com a formação de gelo, pois as suspensões de vitrificação não cristalizam durante o resfriamento, estocagem ou nas etapas de aquecimento (Rall e Fay, 1985). Este comportamento físico pode ser obtido com o aumento da concentração dos crioprotetores, que tem por efeito uma elevação extrema da viscosidade da solução e/ou aumento das taxas de resfriamento e aquecimento (Leibo e Songsasen, 2002). Atualmente, outros fatores, como, por exemplo, o volume da solução crioprotetora, têm sido levados em consideração para otimizar os resultados de sobrevivência embrionúria obtidos com a vitrificação (Vajta et al. 1998; Vajta, 2000). O desafio da vitrificação está em alcançar os índices de sobrevivência embrionária observados com o resfriamento gradual do sistema (quasi-equilibrium, Mazur, 1990). Os aditivos crioprotetores, nas concentrações necessúrias para induzir à vitrificação, podem exercer efeitos tóxicos, de natureza química ou osmótica, sobre o metabolismo celular (Dobrinsky, 2002).
A escolha do etileno glicol (EG) para os experimentos levou em consideração as observações de Kasai et al. (1990) e as realizadas por Bertolini et al. (1994), Aguiar et al. (1997) e Paixão Côrtes e Rodrigues (2000), que utilizaram altas concentrações de EG para vitrificar embriões murinos neste laboratório. Segundo os pesquisadores, este crioprotetor, além da vantagem de possuir baixa toxicidade, apresenta menor peso molecular que o DMSO, glicerol e propileno glicol, o que facilita sua rápida permeação para o interior da célula durante um curto período de exposição, sendo também, removido rapidamente da célula durante o aquecimento. Comentam ainda que o EG penetra no espaço intracelular praticamente na mesma velocidade em que a água deixa este espaço, até ser alcançado o equilíbrio osmótico do sistema.
Os objetivos dos experimentos foram, primeiramente avaliar a taxa de eclosão de blastocistos expandidos, após a exposição às soluções crioprotetoras. Segundo, determinar a capacidade de eclosão dos blastocistos expandidos, após a vitrificação em palhetas de 0,25 mi ou 0,12 mi na presença ou na ausência de óleo mineral no interior das palhetas.
Materiais e Métodos
Os experimentos foram realizados com machos e fêmeas da espécie Mus domesticus domesticus, linhagem CF I suíça albina, sendo classificados geneticamente como heterogênicos, e sanitariamente como convencionais. A idade das fêmeas doadoras variou de 6 a 8 semanas, que eram acasaladas com machos férteis em idade reprodutiva (8 a 24 semanas). No local de alojamento eram controladas a temperatura de 22°C (± 2°C ) e a iluminação de 14 horas luz diárias (das 8:00 às 22:00 horas). A alimentação era oferecida ad libitum e consistia em ração peletizada e água. A superovulação e sincronização do ciclo estral das doadoras foram realizadas mediante a aplicação, via intraperitonial, de 0,2 ml (10 UI) de hCG às 15 horas, seguida da aplicação de 0,2 mi (10 UI) de hCG 46 horas após. Foram utilizados grupos de oito fêmeas por tratamento. Depois da aplicação de hCG, as fêmeas foram colocadas com machos inteiros para a cobertura. Na manhã seguinte ao acasalamento, entre as 7 e 8 horas, era verificada a presença do tampão vaginal nas fêmeas, sinal da ocorrência de cópula, sendo estas separadas para posterior colheita dos embriões. Convencionou-se denominar este dia como DIA I da prenhez. As colheitas dos embriões foram realizadas na manhã do DIA 4 da prenhez, entre as 6 e 8 horas. As doadoras eram sacriticadas, os cornos uterinos removidos e colocados em gotas da solução salina fosfatada tamponada de Dulbecco (1954); Vogt (1954) modificada por Whittingham (1971), PBSm. Aproximadamente 0,2 ml da solução de colheita era perfundida através do lúmen dos cornos uterinos, sendo este procedimento realizado sob lupa estereomicroscópica com luz incidente e magnitude de 10 X. Imediatamente após o líquido da lavagem uterina era examinado com aumento de 60 X, para a identificação e seleção das estruturas embrionárias. Os embriões selecionados eram lavados através da passagem sucessiva por gotas de PBSm e posteriormente realizava-se a avaliação individual do estádio e da qualidade morfológica das estruturas embrionárias. Os embriões no estádio de blastocisto expandido, considerados "excelentes" (grau I), quanto ao aspecto morfológico, sem presença de blastômeros extrusos, apresentando um contorno regular, simétrico e a zona pelúcida intacta com cor e aspecto característicos para a espécie, foram selecionados e distribuídos de forma aleatória entre os tratamentos dos experimentos.
Os procedimentos de vitrificação dos blastocistos expandidos foram realizados com o emprego de duas soluções crioprotetoras compostas por PBSm, sendo a primeira com o acréscimo de 1,8 M EG e 6% de BSA (SD) e a segunda com o acréscimo de 9,0M EG e 6% de BSA (SV).
No experimento I, após a identificação e seleção dos embriões, grupos de 10 blastocistos expandidos eram transferidos para um vidro relógio, que continha 0,5 ml da SD, por um período de 2 minutos, à temperatura de 20°C. Após, os embriões eram transferidos, com o auxílio de um bucal acoplado a uma micropipeta de vidro, para o interior das palhetas que já continham a solução com 9 M de EG. Passados 30 segundos, o conteúdo da palheta era esvaziado em outro vidro relógio, que continha 2 ml de PBSm acrescido de 0,4% de BSA.
Foram utilizados dois tipos de palhetas: as francesas de 0.25 ml (IMV, França) e palhetas modificadas com a redução do volume para de 0.12ml. As palhetas de 0,25 ml tiveram o seu volume reduzido através do aquecimento sobre placa térmica e posterior tensão mecânica, sendo esticadas até o dobro do seu comprimento. Logo após, eram cortadas, com uma lâmina, na extremidade mais fina e padronizadas (volume de 0,12 ml), com o auxílio de micropipetas volumétricas.
As palhetas de 0,25 ml foram preenchidas com um volume total de 0,1 ml da solução de vitrificação, sendo a coluna da solução que continha os embriões separada das extremidades por colunas de ar ou por colunas de óleo mineral. Nas palhetas de 0,12 ml, o volume total da solução crioprotetora foi de 0,05 ml, e os métodos de preenchimento utilizados foram os mesmos das palhetas de 0,25 ml. As palhetas permaneciam abertas após o envase dos embriões e eram assim imersas em nitrogênio líquido.
Para o reaquecimento do sistema, as palhetas eram retiradas do nitrogênio líquido, secas em papel toalha e mantidas à temperatura ambiente por 10 segundos. Em seguida, seu conteúdo era esvaziado em uma placa de vidro relógio contendo 2 ml de PBSm + 0,4% de BSA. Após a identificação, os embriões eram lavados pela passagem sucessiva através de diferentes gotas do PBSm, promovendo-se a retirada total do crioprotetor.
Para o cultivo in vitro dos embriões, eram preparadas placas de Petri (diâmetro 35 mm) com cinco gotas de 50 μl PBSm. As gotas eram então cobertas com óleo mineral (Sigma, ref. M8410) e, após receberem os embriões, eram armazenadas em estufa a 37ºC em atmosfera de 5% de C02 e 100% umidade relativa do ar. Em uma das gotas eram alocados os embriões recém-coletados (grupo controle), enquanto as outras quatro gotas recebiam embriões submetidos aos diferentes tratamentos. A avaliação da viabilidade embrionária foi determinada pela taxa de eclosão dos embriões após 48 h de cultivo in vitro.
O experimento I foi replicado quatro vezes e o experimento II, onze vezes. Os dados obtidos nos diferentes tratamentos foram analisados pelo teste do qui-quadrado com um nível de significância de 5%. Quando o teste indicou diferença significativa, realizou-se a análise de resíduos.
Resultados
Experimento I
A análise dos dados contidos na Tabela I, revela que a exposição dos embriões às soluções crioprotetoras e a presença ou ausência do óleo mineral nas palhetas não afetaram a capacidade de eclosão dos blastocistos, quando comparada a dos embriões do grupo controle.
Tabela I. Taxas de eclosão de blastocistos Mus domesticus domesticus após a exposição às soluções de vitrificação.
Os resultados sumarizados na Tabela II revelam que não houve diferença estatística entre os tratamentos de vitrificação testados. A utilização de palhetas modificadas sem a presença de óleo mineral (tratamento II) propiciou uma taxa de eclosão embrionária significativamente superior às taxas de eclosão observadas nos demais tratamentos, equiparando-se ao grupo controle (tratamento V). O tratamento III, onde foram utilizadas palhetas normais e óleo mineral, apresentou a menor taxa de sobrevivência embrionária, enquanto os tratamentos I e IV propiciaram resultados que não diferiram significativamente entre si.
Tabela II. Taxas de eclosão de blastocistos Mus domesticus domesticus após vitrificação, reaquecimento e cultivo por 48 horas.
FIGURA 1. Palheta de 0,25 ml e palheta modificada para 0,12 ml
Discussão
As soluções de vitrificação utilizadas para a execução deste experimento foram testadas previamente por inspeção visual quanto à manutenção do estado amorfo, tanto na vitrificação quanto na desvitrificação. A inspeção visual é um critério que deve ser levado em consideração (Fahy et al., 1984; Kasai et al., 1990) para determinar a manutenção do estado vítreo da solução após a imersão em nitrogênio líquido e durante a fase do aquecimento.
Os dados relatados por Kasai et al. (1990), quando testaram a ação tóxica de diferentes concentrações de EG (5,4M, 7,2M e 9,0M) sobre a viabilidade de mórulas de Mus domesticus domesticus, as taxas de desenvolvimento até blastocisto expandido após o cultivo foram de 98% (48/49), 84% (42/50) e 0% (0140), respectivamente. Os baixos resultados descritos pelos autores com a maior concentração de EG devem-se provavelmente ao tempo excessivo de exposição (20 minutos) dos embriões ao crioprotetor. Esta observação foi corroborada pelos mesmos autores (Kasai et al.. 1992b), que obtiveram uma taxa de sobrevivência que variou de 95 a 100% quando expuseram mórulas de camundongo à solução EFS por períodos entre 2 e 5 minutos. Por outro lado, com o aumento do tempo de exposição para 10 minutos, as taxas de sobrevivência embrionária foram significativamente reduzidas para 78%, quando a temperatura de exposição era de 20°C, e para 0% em temperatura de 25°C. Períodos de tempos prolongados associados a elevadas temperaturas de exposição aos crioprotetores aumentam a permeabilidade das membranas celulares, o que pode provocar danos às organelas celulares, acarretando prejuízos ao desenvolvimento embrionário.
Ali & Shelton (1993b) comentaram que a concentração do crioprotetor e o seu coeficiente de permeabilidade é que determinam o efeito tóxico, de origem osmótica ou bioquímica, das soluções crioprotetoras, sobre as células embrionárias, e que a alta permeabilidade do EG reduz os danos causados pelo choque osmótico. Os resultados do presente experimento corroboram estas conclusões, já que, mesmo expondo os embriões a concentrações elevadas do crioprotetor, não foi observada toxicidade. A ausência de efeitos deletérios da solução de 9,0 M de EG sobre a viabilidadeembrionária também foi relatada por Paixão Côrtes e Rodrigues (2000), que observaram 91% (30/33) de eclosão em blastocistos após a exposição de blastocistos as mesmas soluções crioprotetoras. Na opinião de Rall (1987), a intensidade da toxicidade causada pelo crioprotetor está diretamente relacionada com concentração da solução, com o tempo e a temperatura de exposição. O aumento da velocidade nas taxas de resfriamento e aquecimento durante a vitrificação foi proposto por Mazur (1990), quando caracterizou o congelamento denominado "nonequilibrium". De acordo com o autor, a desidratação do embrião antes de a temperatura ser diminuída e o posterior resfriamento, rápido e sem equilíbrio, resultariam na formação de pequenos e inócuos cristais de gelo intracelulares ou na conversão da solução intracelular em estado vítreo. Nestes procedimentos, para se obterem altas taxas de sobrevivência, necessita-se de um reaquecimento rápido o suficiente para evitar a cristalização. Considerando que quanto menor for o volume de solução e mais fina for a parede da palheta, maior será a velocidade com que a solução vai resfriar e reaquecer, a modificação das palhetas proposta neste experimento objetivou otimizar a taxa de sobrevivência dos blastocistos expandidos vitrificados.
Pedro et al. (1997) destacaram que o tempo de retirada ou diluição do crioprotetor tem efeito significante sobre a sobrevivência dos embriões criopreservados.
A alta viscosidade da solução de vitrificação, necessária para evitar a formação de cristais de gelo durante o processo de criopreservação, causa também uma maior dificuldade para a busca e identificação das estruturas embrionárias após o reaquecimento do sistema. A presença do óleo mineral tornou a procura ainda mais difícil, e, com isto, os embriões permaneciam mais tempo expostos à solução concentrada de crioprotetor em temperatura elevada. A temperatura (37°C) de reaquecimento foi outro fator que pode ter contribuído para a redução da viabilidade dos embriões. Esses danos, associados aos danos osmóticos causados pelo tempo maior de exposição ao crioprotetor, podem ter sido a causa da baixa sobrevivência observada no tratamento III. O propósito da utilização do óleo mineral foi proteger, de uma forma indireta, os embriões durante a congelação. Sempre que as palhetas de vitrificação são transferidas para o nitrogênio líquido, ocorre uma turbulência no sistema (Vajta et al., 1998). Este fenômeno poderia fazer com que os embriões fossem desalojados da solução de vitrificação para o espaço das colunas de ar, ficando, desta maneira, sem a proteção da solução crioprotetora. A presença do óleo mineral serviria como uma barreira de proteção, não permitindo o deslocamento destes embriões durante a ocorrência da turbulência.
A formação de vapor de nitrogênio em torno das palhetas, durante o procedimento de vitrificação, de acordo com Vajta et al. (2000), pode ter sido uma causa da redução da velocidade de resfriamento do sistema. O método OPS proposto por Vajta et al. (1998) oferece inúmeras vantagens, mas requer habilidade técnica e palhetas com diâmetros específicos, o que dificulta a sua utilização nas rotinas de congelação de embriões mamíferos. Ao contrário, a proposta deste experimento foi empregar uma técnica que se aproximasse do método proposto por este autor e que apresentasse como vantagem ser de fácil execução.
Outro fator de influência sobre os resultados do procedimento é o citado por Dobrinsky (1996), de que o processo de vitrificação provoca uma desestruturação do citoesqueleto das células embrionárias, alterando a arquitetura dos microtúbulos e microfilamentos. A solução testada neste experimento pode ter facilitado ou desencadeado estas alterações no citoesqueleto celular, culminando por diminuir a viabilidade dos embriões após o reaquecimento.
Os resultados obtidos neste experimento, com a utilização de palhetas esticadas, foram inferiores aos relatados por Kasai et al. (1992a), que alcançaram 87% de eclosão em blastocistos vitrificados na solução EFS e por Ishimori et al. (1992), com 90% de eclosão de blastocistos Mus domesticus domesticus. Estes resultados podem estar relacionados a dois fatores: primeiramente a menor concentração de EG contida na solução EFS (40%) em relação à concentração de 50% utilizada neste trabalho; e segundo, pela presença de Ficoll e sacarose na solução EFS, o que permite a obtenção de um gradiente osmótico menor, com trocas hídricas mais lentas, através das membranas celulares. Considerando as colocações de Vajta et al. (1998), de que o aumento da velocidade nas trocas de temperatura decresceria a concentração de crioprotetor requerida para que a solução alcançasse o estado vítreo, diminuindo com isso os danos tóxicos e osmóticos, talvez possam otimizar os resul tados de sobrevivência embrionária utilizando outras soluções de criopreservação em associação ao EG com o envase dos embriões nas palhetas modificadas.
Comrarando os dados de sobrevivência embrionária obtidos anteriormente no Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução da UFRGS por Paixão Côrtes e Rodrigues(2000), que alcançaram os 49% (19/49), observamos que no tratamento I, onde a solução de vitrificação, tempo de equilíbrio e temperatura foram semelhantes, a taxa de eclosão dos blastocistos expandidos foi também semelhante 52,41 % (76/145). Por outro lado, quando houve a utilização das palhetas modificadas, os resultados foram superiores 68,71% (101/147).
Conclusões
Os resultados de viabilidade embrionária medidos pelas taxas de eclosão observadas nas condições em que estes experimentos foram real izados, permitem concluir que a exposição de blastocistos MIIS domesticus domesticlls à solução 9,0 M de EG + 6% de BSA em PBSm, com exposição prévia à solução de PBSm + 1, 8 M de EG + 6% de BSA, não afetou as taxas de eclosão embrionária in vitro. A utilização de palhetas de 0, 12 ml para vitrificação rropiciou taxas de sobrevivência embriomíria significativamente superiores às obtidas com as palhetas de 0,25 ml. A presença de óleo na palheta de vitrificação, independentemente do volume, foi prejudicial à sobrevivência embrionária in vitro de blastocistos expandidos de Mus domesticus domesticus vitrificados.