JBRA Assist. Reprod. 2003; 07(1):34-39
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2003.7.1.09
1ORIGEM - Centro de Medicina Reprodutiva - Belo Horizonte
2Faculdade de Medicina da UFMG
Resumo
Introdução: O uso dos análogos do GnRH em ciclos de reprodução assistida foi um importante marco para facilitar a técnica e melhorar os resultados. Diversos tipos de análogos têm sido utilizados, desde os de aplicação diária até os de efeito prolongado. Neste caso, a possibilidade de haver uma ação sobre a fase lútea pode ser aventada.
Objetivos: Avaliar se o efeito prolongado dos análogos do GnRH de depósito, utilizados em ciclos de reprodução assistida, apresenta algum efeito sobre as taxas de gestação pela sua ação durante a fase lútea.
Material e Métodos: Foram analisadas retrospectivamente 367 pacientes submetidas a ciclos de reprodução assistida para tratamento de infertilidade, no período de janeiro de 1998 a dezembro de 2000, e que estavam em uso de 3,6 mg de Goserelin (Zoladex - Zeneca - Brasil) para supressão da função hipofisária. As pacientes foram separadas em 3 grupos de acordo com o tempo de ação dos análogos sobre a fase lútea: Grupo 1, < 6 dias; Grupo 2, 7 a 12 dias e Grupo 3, > 12 dias. Foram analisados também, a resposta ovariana, a idade, número de embriões transferidos e taxa de gravidez de cada grupo.
Resultados: O grupo 1 apresentou 53 pacientes com idade média de 33,8 anos (variação de 23-44 anos); uma média de 3,05 embriões transferidos, e uma taxa de gestação de 45,2%; O grupo 2 apresentou 118 pacientes com idade média de 33,5 anos (variação de 24 a 44a); uma média de 3,2 embriões transferidos, e uma taxa de gestação de 38,9%; O grupo 3 apresentou 196 pacientes com idade média de 33,8 anos (variação de 23 a 43a); uma média de 3,41 embriões transferidos, e uma taxa de gestação de 47,4% (p=0,89)
Conclusões: Nosso estudo demonstrou uma tendência a se ter um aumento nas taxas de gestação quando o efeito dos análogos do GnRH se mantêm por mais de 6 dias durante a fase lútea. Este achado demonstra um possível benefício em se utilizar os análogos de depósito durante tratamento com técnicas de fertilização in vitro. Esse aumento, entretanto, não foi significativo, sendo necessários estudos com maior número de pacientes para se comprovar esses resutados.
Palavras-chave:análogos do GnRH, fertilização in vitro, gravidez, fase lútea.
AbstractIntrodução
O uso dos análogos dos hormônios liberadores das gonadotrotinas (GnRHa) representou um importante marco para as técnicas de reprodução assistida, pois ao inibir o pico do hormônio luteinizante (LH), diminuiu as punções de urgência devido à rotura folicular precoce. No fim dos anos oitenta, a maioria dos centros já os empregava associados com menotrofinas (hMG) nos protocolos de estimulação ovariana (Rutherford et al, 1988; Meldrum et al., 1989; Lejeune et al, 1990). Os protocolos mais utilizados são o curto ou longo. No curto, inicia-se o uso do GnRHa no início do ciclo menstrual, para se estimular o efeito de flare up (descarga inicial de gonadotrofinas endógenas) que irá potencializar o efeito das gonadotrofinas administradas por via exógena (FSH recombinante, hMG). Com isso, acredita-se obter uma superovulação mais potente e com menor dose de gonadotrofinas. Para esse protocolo, os análogos são utilizados diariamente, e seu uso é interrompido no dia da administração do hormônio da gonadotrofina coriônica (hCG) para indução da maturação oocitária.
No protocolo longo, o uso dos análogos pode ser iniciado tanto na fase folicular precoce (± 2o dia do ciclo) quanto na fase lútea tardia (± 21o dia o ciclo). Nesse protocolo, é fundamental que ocorra a dessensibilização hipofisiária antes de se iniciar a indução da foliculogênese. As vias de administração podem ser tanto intranasal e subcutânea diária quanto através de preparações de liberação lenta ou de depósito (Leyendecker et al, 1983; Fleming et al, 1988; Dodson et al, 1987; Geber et al., 2002). Inúmeras vantagens estão associadas ao uso de GnRHa nos protocolos de reprodução assistida. A principal delas é a supressão do pico de LH, tanto a sua fração imunológica quanto a biologicamente ativa (Meldrum et al, 1984; Mortola et al, 1989), prevenindo, assim, a rotura folicular antes do momento da aspiração e os efeitos indesejáveis de uma luteinização excessiva sobre a qualidade do ovócito (Stanger et al, 1985; Dodson et al, 1987). Uma vantagem adicional de seu uso combinado com gonadotrofinas exógenas seria um maior número de folículos recrutados, que de acordo com alguns autores pode ser obtido usando-se protocolos longos (Tan et al, 1992; Filicori et al, 1996). Uma possível explicação para esse efeito é a redução da produção de andrógenos pelo ovário salvando um número maior de folículos da atresia. É descrito também um aumento no número e na viabilidade de embriões (Chetkowski et al, 1991; Tummon et al, 1992), e também nas taxas de gravidez (Chetkowski et al, 1989; Abdalla et al, 1990; Polson et al, 1991; Hughes et al, 1992). Não está descrito um aumento no risco de anormalidades cromossômicas (Tejada et al, 1991) e a taxa de aborto é aparentemente menor (Abdalla et al, 1990) ou igual (Homburg et al, 1990) ao observado em ciclos sem uso dos análogos.
Um dos pontos que ainda continua pouco estudado é o efeito dos análogos durante a fase lútea. Smitz et al. (1988) demonstraram que pacientes submetidas a tratamento com fertilização in vitro(FIV), com GnRHa e HMG, e sem suporte de fase lútea, apresentavam fase lútea inadequada. Os mesmos autores (Smitz et al., 1992) posteriormente demonstraram que o efeito do GnRHa persiste até a fase lútea, conforme demonstrado pela avaliação dos níveis séricos de LH e FSH. A partir de ambos estudos, pôde-se demonstrar a necessidade de se suplementar a fase lútea com progesterona ou gonadotrofina coriônica humana (hCG). O que ainda persiste sem resposta é se esse efeito dos análogos do GnRH sobre a fase lútea teria alguma interferência sobre os resultados de gestação.
O intervalo de tempo decorrido entre o início da dessensibilização hipofisária e a indução da maturação oocitária pelo hCG, varia de acordo com cada paciente. No caso do uso de análogos do GnRH de depósito (ação prolongada) o tempo em que o mesmo permanece ativo na fase lútea também será variável. Conseqüentemente, esta diferença no tempo de ação, na fase lútea, poderia ser um fator a interferir nas taxas de gestação. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar se o efeito prolongado da ação dos análogos do GnRH de depósito, na fase lútea, em ciclos de reprodução assistida, apresentaria interferência sobre as taxas de gestação.
Materiais e Métodos
Foram analisados retrospectivamente 367 ciclos de reprodução assistida para tratamento de infertilidade conjugal realizados na Clínica ORIGEN (Belo Horizonte - MG), no período de janeiro de 1998 a dezembro de 2000. Foram incluídos no estudo somente os casos em que foram utilizados análogos de depósito (Goserelin 3,6 mg - Zoladex - Zeneca - Brasil), para supressão da função hipofisária pelo protocolo longo.
Todas as pacientes foram submetidas à propedêutica completa para infertilidade e, apenas aquelas que apresentaram níveis séricos do hormônio folículo-estimulante (FSH) <15 mUI/ml, no terceiro dia do ciclo menstrual, foram incluídas no estudo. Para os casais que apresentaram contagem de espermatozóides < 2,5 X 106 no dia da inseminação, foi realizada a injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI).
Indução da Ovulação
O tratamento era iniciado com a administração subcutânea de 3,6 mg de análogo do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRHa - Goserelin - Zoladex - Zeneca - Brasil) para supressão da função hipofisária (protocolo longo), tanto no 2o quanto no 21o dia do ciclo menstrual (Geber et al., 2002). O bloqueio da função hipofisária era confirmado quando a paciente apresentava níveis séricos de estradiol (E2) < 30 pg/ml e espessura endometrial < 3 mm à ultra-sonografia endovaginal. Todas as pacientes realizavam ambos exames a partir de 10 dias após a aplicação do GnRHa. Uma vez confirmada a supressão hipofisária, as pacientes eram consideradas aptas para iniciar a indução da foliculogênese. Se elas ainda não estivessem prontas, a dosagem do E2 sérico e o ultra-som eram repetidos a cada 2 dias até que a supressão fosse alcançada.A indução da superovulação era feita com doses diárias de gonadotrofinas humanas (hMG - Pergonal - Serono - Brasil) durante 4 dias, seguido por FSH recombinate (rFSH - Puregon - Organon - Brasil). A dose inicial de hMG era definida de acordo com a idade da paciente e ajustada de acordo com a resposta ovariana, monitorizado através de ultra-sonografia endovaginal (Tosbee - Toshiba-Japão) e dosagem do E2 sérico. Para todas as pacientes foram utilizados os mesmos critérios. A indução da maturação oocitária era provocada utilizando-se o 10.000 UI de hCG (Profasi - Serono - Brasil) quando no mínimo dois folículos atingiam pelo menos 17mm de diâmetro com níveis concordantes de E2.
Fertilização in vitro, ICSI e Transferência de Embriões
A captação oocitária era realizada aproximadamente 34 horas após a administração do hCG, por aspiração guiada por ultrasom vaginal. Os oócitos eram inseminados aproximadamente 5 horas depois (Dia 0), tanto pela técnica clássica de FIV com aproximadamente 30.000 espermatozóides móveis/oócito, quanto por ICSI. O preparo do sêmen era feito pela técnica de Swim up. A micromanipulação era realizada sobre uma placa aquecedora colocada em um microscópio invertido com aumento de 400 vezes (Nikon Diaphot - Japão), adaptado com um par de micromanipuladores hidráulicos e controle elétrico (Narishige - Japão). Um único espermatozóide era aspirado pela pipeta de injeção, a partir de uma gota de meio de cultura tamponado (HEPES-buffered Earle’s balanced salt solution - Sigma - USA), contendo 10% de polyvinylpirolidone (PVP - Irvine - USA). Os oócitos eram mantidos em uma pipeta de sustentação, enquanto a pipeta de injeção era empurrada através da zona pelúcida para dentro do citoplasma, e um único espermatozóide era então injetado.No dia seguinte, 17-19 horas após a inseminação (Dia 1), os oócitos eram checados para se confirmar a fertilização, através da presença de dois pró-núcleos. Os embriões foram cultivados em gotas de 20 ml de solução balanceada de Earle (EBSS - Sigma) acrescida de 10% de soro sintético a 370C em placa de Petri (Falcon - BD - USA), coberto com óleo mineral (Sigma), em mistura gasosa contendo 5% de CO2 (Geber & Sampaio, 1999). No dia 2 ou 3 após a captação oocitária, os embriões eram examinados e, no máximo, 4 eram selecionados para a transferência, dependendo da idade da paciente. No caso da transferência ser realizada em estágio de blastocisto, os embriões eram transferidos para o meio S2 (Scandinavian IVF - Sweeden) até o 5o dia, quando um máximo de 3 blastocistos eram transferidos (Sampaio & Geber, 2001).O suporte de fase lútea era feito com progesterona vaginal (Utrogestan - França - 600mg/dia) por 12 dias. O nivel sérico de hCG era dosado 12 dias após a transferência dos embriões. A confirmação da gravidez era feita através de ultrasonografia endovaginal duas e quatro semanas depois. Todas as gestações foram seguidas por, pelo menos, 20 semanas.
Efeito dos Análogos do GnRH na Fase Lútea
Para fins de cálculo da duração do efeito dos análogos do GnRH na fase lútea, contamos o número de dias desde a sua administração até 2 dias depois do uso do hCG (momento que iniciou-se o suporte de fase lútea). O número de dias encontrado foi subtraido de 40, partindo-se do principio de que esta é a duração máxima do análogo (Perry & Brogden, 1996).Este valor obtido correspondeu ao número de dias em que o GnRHa permaneceu ativo na fase lútea. Assim, para fins de comparação, as pacientes foram separadas em 3 Grupos, de acordo com o tempo de ação dos análogos na fase lútea: Grupo 1: < 6 dias; Grupo 2:7a12 dias e Grupo 3:>12 dias. Os dados analisados e comparados foram: idade, causa da infertilidade, número de ampolas utilizadas, número de foliculos, número de oócitos obtidos, número de embriões transferidos e taxa de gravidez.
Análise Estatística
Para a análise estatistica, foram utilizados o teste t de student para as variáveis continuas e o qui quadrado para as variáveis dicotômicas (gravidez). Os resultados são apresentados por média ± desvio-padrão. Todos os resultados foram considerados significativos para uma probabilidade de significáncia inferior a 5% (p < 0,05), tendo, portanto, pelo menos 95% de confiança nas conclusões apresentadas.
Resultados
O número total de pacientes analisadas foi de 367, sendo que 53 estavam no Grupo 1, 118 no Grupo 2 e 196 no Grupo 3. A idade média das pacientes foi de: Grupo 1 - 33,8 ± 4,55 anos (23-44 anos); Grupo 2-33,7 ± 4,5 anos (24-44 anos) e Grupo 3-33,7 ± 4,4 anos (23-43 anos), (diferença não significante). Dentre as causas de infertilidade apresentadas pelas pacientes, o fator masculino foi o mais prevalente em todos os grupos, e não identificamos diferença significativa entre os grupos quando analisamos as diferentes causas de infertilidade.
O número médio de ampolas utilizadas para indução da foliculogênese também não foi diferente estatisticamente (p > 0,05), sendo de 47,8 ± 14,2 (variação de 24 a 86) no Grupo 1; 44,2 ± 10,4 (variação de 23 a 80) no Grupo 2; e 42,5 ±10,1 (variação de 16 a 66) no Grupo 3. O tempo de indução da foliculogênese, em dias, também foi semelhante nos três grupos, isto é, no grupo 1 foi de 12,08 ± 1,45 (variação de 8 a 15); no grupo 2 de 11,9 ± 1,34 (variação de 8 a 16) e no grupo 3 de 11,7 ± 1,48 (variação de 8 a 16). O número médio de foliculos observados ao ultra-som no dia da administração do hCG foi de: Grupo 1: 9,3 ± 5,6 (variação de 1 a 31); Grupo 2: 11,1 ± 6,15 (variação de 3 a 32) e Grupo 3: 11,2 ± 5,2 (variação de 2 a 20) (não significante). Com relação ao número de oócitos aspirados, também não identificamos diferença estatisticamente significativa. No Grupo 1 foram encontrados 11,1 ± 6,5 (variação de 2 a 33) oócitos; no Grupo 2, 12,7±7,8 (variação de 2 a 35) e no Grupo 3, 13,8 ± 7,4 (variação de 3 a 35).
A média de embriões transferidos foi a única variável que apresentou diferença significativa entre os Grupos. No Grupo 1 tivemos uma média de 3,05 ± 1,3 embriões (variação de 1 a 4); no Grupo 2, 3,2 ± 1,3 embriões (variação de 1 a 4); e no Grupo 3, 3,41 ± 1,3 embriões (variação de 1 a 4). A diferença foi significativa, entretanto, quando comparados os Grupos 1 e 3, sendo o Grupo 2 semelhante aos demais. Não houve diferença entre os 3 grupos com relação ao dia da transferência embrionária, isto é, a proporção foi semelhante nos 3 grupos de embriões transferidos nos dias 2, 3 ou 5.
Com relação à taxa de gravidez, novamente não observamos diferença significativa entre os três Grupos. As taxas de gestação foram de 45,2%, 38,9% e 47,4%, respectivamente, para os Grupos 1, 2 e 3.
Discussão
Entendemos que este é o primeiro estudo que avalia clínicamente os efeitos dos análogos do GnRh de ação prolongada sobre a fase lútea de ciclos de FlV, com suporte de progesterona e suas conseqüências nas taxas de gestação. Mais ainda, comparamos se diferentes períodos de tempo de ação, poderiam ter ações diferentes nestas taxas.
A introdução do uso dos análogos do GnRH em ciclos de Reprodução Assistida trouxe diversos benefícios para o tratamento da infertilidade, culminando com o aumento nas taxas de gestação. Seu uso, entretanto, criou uma inadequação da fase lútea descrita por Smitz et al. (1987) e Smitz et al. (1988). Assim, diversos protocolos para se avaliar a necessidade de se suplementar a fase lútea, foram propostos. Ficou demonstrado, em todos os casos, que este suporte era benéfico para o tratamento, quando associado a indução com análogos do GnRH e gonadotrofinas (Soliman et al., 1994).
O motivo mais provável para explicar essa inadequação da fase lútea seria a ausência de estímulo do LH para as células luteinizadas derivadas das células da teca, que produzem estrogênio e progesterona. Essa ausência seria responsável pela diminuição nas concentrações séricas desses hormônios observadas 8 dias após a injeção de hCG.
Outro fator importante seria o efeito direto dos análogos sobre a função do corpo lúteo sugerida por Pellicer & Miro (1990) e Brus et al. (1997). Esse efeito seria mediado por receptores presentes nas células da granulosa e da teca (Peng et al., 1994). Até o momento, não existe consenso na literatura se haveria ou não, algum efeito inibitório na esteroidogênese. Pellicer & Miro (1990) e Brus et al. (1997), descreveram uma diminuição na produção dos esteróides ovarianos pelas células da granulosa e da teca, em ensaios realizados in vitro. Por outro lado, em estudos também realizados in vitro,Casper et al. (1982) e Dodson et al. (1988) não confirmaram estes achados. A alteração na fase lútea após o uso dos análogos, por sua vez, pode interferir negativamente e de forma crucial no preparo endometrial para a implantação embrionária. Assim, alterações nas secreções de estrogênio e progesterona produzem um desequilíbrio, atrasando a maturação endometrial. Esse atraso, entretanto, não foi observado em pacientes que utilizaram suplementação de fase lútea (Bourgain et al., 1994). De forma semelhante ao observado nos ovários, o efeito dos análogos do GnRH pode ser responsável por ações diretas nas células endometriais, uma vez que a expressão do RNA mensageiro do GnRH foi encontrada no tecido endometrial, principalmente na fase lútea (Dong et al., 1998; Raga et al., 1998).
O uso dos análogos do GnRH também não interfere na qualidade dos embriões (Benshushan, 1993) ou na evolução de gestações mesmo se usado em suas primeiras semanas de evolução (Wilshire, 1993; Taskin, 1999). Também foi demonstrado que o desenvolvimento físico, neurológico e mental de crianças nascidas após métodos de fertilização in vitro usando análogos de GnRH não difere do de crianças nascidas de gestações espontâneas (Ron-El, 1994).
Nosso estudo demonstrou que o tempo de exposição aos análogos do GnRH não interfere com os resultados clínicos de gravidez em ciclos de Reprodução Assistida, com suplementação de fase lútea com progesterona. Estes achados, inéditos na literatura, sugerem uma ausência de efeitos negativos diretos, desta medicação, sobre implantação.
Além disso, observamos uma tendência a um aumento nas taxas de gestação quando o efeito dos análogos do GnRH se mantinha por mais de 12 dias durante a fase lútea, suplementada com progesterona. Este achado sugere um possível benefício do efeito prolongado dos análogos em ciclos de Reprodução Assistida. Este aumento, entretanto, não foi significativo, sendo necessários estudos com maior número de pacientes para se comprovar esses resultados.