JBRA Assist. Reprod. 2005;09(s1):11-15
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2005.9.s1.02
Biópsia de embriões e amplificação do DNA por PCR para diagnóstico pré-implantação de doenças genéticas
Embryos biopsy and DNA amplification to preimplantation diagnosis of the genetics diseases
Clínica Origen - Centro de Tecnologia em Genética e Reprodução Humana
RESUMO
INTRODUÇÃO
O objetivo de nosso estudo foi realizar a biópsia em embriões e proceder a amplificação genética dos blastômeros pela técnica de PCR, utilizando dois tipos de seqüências para identificação do sexo, evitando-se dessa forma a transmissão de doenças sexualmente transmissíveis. Talvez pela primeira vez na literatura, analisou-se a capacidade de amplificação de blastômeros após 3 dias em co-cultura com os embriões após diferenciação em células do trofectoderma.
MATERIAL E MÉTODOS
Um total de 50 embriões normalmente fertilizados após ICSI e biopsiados no início do dia 3, foram incluídos no estudo. 25 blastômeros analisados apresentaram amplificação. A confirmação do sexo observado à análise por PCR foi realizada através da amplificação de outro blastômero proveniente do mesmo embrião.
RESULTADOS
Em 19 casos (76%) os resultados iniciais foram confirmados. Nos 6 casos em que não houve confirmação, 3 foram por falha de amplificação e 3 por amplificações discordantes. A proporção entre os sexos dos blastômeros amplificados foi de 13 do sexo masculino e 9 do sexo feminino. Em 3 casos houve falha de amplificação e em 3 casos do sexo masculino, o blastômero do mesmo embrião amplificou de maneira discordante. A confirmação da amplificação dos blastômeros do sexo feminino ocorreu em 8 dos 9 dos casos (89%), no sexo masculino, a confirmação ocorreu em 9 dos 13 blastômeros (709%). Em todos os 7 casos de células do trofectoderma a amplificação ocorreu de forma concordante em todos os blastômeros (100% de amplificação). Nas células em que foram utilizadas a seqüência de SRY para amplificação observamos um total de 72% de falha (18/25 células), com a amelogenina, esta taxa de falha foi de 20%, isto é, 3 em 15 células analisadas.
CONCLUSÃO
A possibilidade de biopsiar embriões humanos no dia 3 pós FIV e amplificar o DNA dos blastômeros pela técnica de PCR foi confirmada. Mais ainda, demonstra a possibilidade de amplificação de DNA em blastômeros multiplicados in vitro até a diferenciação em células do trofectoderma, com elevada confiabilidade. Desta forma, poderemos aumentar o número de células disponíveis para diagnóstico genético permitindo análises variadas e maior sensibilidade.
Unitermos: embrião, pré-implantação, ICSI, PCR, determinação do sexo.
ABSTRACT
INTRODUCTION
Preimplantation diagnosis has been used to detect geneticaly transmited diseases in order to avoid transmission to offspring. The amplification of the blastomeres DNA can be achieved by PCR analisys. The objectives of our study is to perform cleavage stage embryo biopsy and posterior PCR analisys of the blastomeres for sex determination. We have also analised the possibility of DNA amplification of trophectoderm cells stage blastomeres.
MATERIAL AND METHODS
A total of 50 embryos were biopsied on day 3 after ICSI. 25 blastomerse presented amplification and the confirmation of the result were obtained after amplification of the other blastomeres of the same embryo. Confrmation was obtained in 76%. A total of 13 blastomeres were inale and 9 female. In all cases where trophectoderm cell were analised confirmation was found. When we used SRY sequente for amplification, we found 72% failure. When we used amelogenine sequente the failure rate was 20%.
CONCLUSION
Our results confirm the possibility to biopsy human embryos at day 3 and to amplify lhe blastomeres by PCR analisys. Moreover, we show the possibility of amplification of trophectoderm cell with high accuracy. This results demonstrate the possibility of aehieving a greater number of cells available for analisys in order to improve the amplification accuracy, and transfer embryos at the blastocyst stage Embryos can also be frozen at day 3 and non affected transfered in a later cycle.
Key words: embryo, preimplantation, ICSI, PCR, sex determination
INTRODUÇÃO
A partir do desenvolvimento das técnicas de fertilização “in vitro” (FIV) (Edwards et al., 1980) e posteriormente de biópsia embrionária (Handyside et al., 1989) associada com o diagnóstico genético através da reação em cadeia de polimerase (PCR) (Li et al., 1988), um novo caminho tem sido traçado no que concerne ao diagnóstico genético pré-implantação. A detecção de doenças geneticamente transmissíveis em estágio bastante precoce, como o anterior à implantação embrionária, permitem a seleção e transferência dos embriões sadios para o útero materno, permitindo que os casais com alto risco de transmissão obtenham uma gravidez sem a doença em questão. Este avanço diagnóstico oferece uma nova alternativa para os casais, evitando o dilema da necessidade da interrupção de uma gestação afetada. Mais ainda, nos casos de doença ligada ao sexo, somente metade dos fetos do sexo masculino seriam afetados, o que levaria a um novo dilema sobre a interrupção da gestação com 50% de chance de não ser afetada.
O estabelecimento das técnicas de FIV de forma rotineira permitiu avanços no conhecimento de cultura de embriões “in vitro”. Após superovulação ovariana, aspiração dos oócitos e inseminação, embriões “in vitro’’ são cultivados rotineiramente até o dia 3, ou mesmo dia 6, quando da formação dos blastocistos. A partir daí, embriões podem ser biopsiados em 1 ou 2 células, sem que isto afete adversamente a capacidade de implantação e desenvolvimento da gestação (Hardy et al., 1990; Handyside et al., 1990).
O advento da técnica de PCR (Li et al., 1988) permite a amplificação de cadeias de DNA previamente estabelecidas, tornando possível a identificação de uma pequena quantidade de DNA, como em um único blastômero, de forma bem rápida. Desta maneira, tornouse factível a realização de biópsia de embriões em estágio pré-implantação, amplificação do seu DNA para diagnóstico genético, e posterior transferência dos embriões sadios nos tempos habituais de FIV.
A injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) foi desenvolvida com o intuito de resolver os casos de infertilidade devido ao fator masculino (Van Steirtegheim et al., 1993) com elevada taxa de fertilização. Sua utilização em associação com a biópsia embrionária poderia permitir uma maior disponibilidade de embriões para biópsia, além de evitar falsos positivos provocados por possíveis espermatozóides aderidos à zona pelúcida, quando da FIV clássica.
O objetivo de nosso estudo foi realizar a biópsia em embriões normalmente fertilizados pela técnica de ICSI e proceder a amplificação genética dos blastômeros removidos pela técnica de PCR, utilizando dois tipos de sequências para identificação do sexo. Analisamos também, talvez pela primeira vez na literatura, a capacidade de amplificação de blastômeros após 3 dias em cocultura com os embriões (dia 6 pós-inseminação) após diferenciação em células do trofectoderma.
MATERIAL E MÉTODOS
Indução da ovulação, ICSI e Cultura de Embriões
Os embriões estudados resultaram de técnica de ICSI. Inicialmente, as pacientes foram submetidas a superovulação utilizando análogos do hormônio liberador das gonadotrofinas (GnRH) e gonadotrofina da menopausa humana (hMG). A monitorização da resposta ovulatória foi realizada através da medida do estradiol sérico e da ultra-sonografia endovaginal (Tosbee-Toshiba, Japão). Uma vez que a paciente apresentasse critério ultrasonográfico e endocrinológico induzia-se a maturação oocitária através da administração de gonadotrofina coriônica humana (hCG). Entre 32 e 36 horas após, realizou-se a aspiração folicular guiada por ultra-som endovaginal, para retirada dos oócitos.Após identificação, os oócitos foram colocados em 20µl de meio de cultura (Solução balanceada de Earle, Sigma), cobertos por óleo mineral, e cultivados na temperatura de 37°C em CO2 a 5%. Após preparo pela técnica de swim-up, espermatozóides foram separados de forma que cada oócito em metáfase II pudesse ser submetido a ICSI, 5 horas após a aspiração.A micromanipulação foi realizada utilizando-se microscópio invertido (Nikon, Japão) sob aumento de 400x. O microscópio era equipado com micromanipuladores hidráulicos de controle motorizado (Narishige, Japão). O procedimento constava inicialmente de identificação e aspiração de um único espermatozóide a partir de uma gota de meio de cultura contendo polivinilpirrolidina. Os oócitos foram mantidos por uma micropipeta de sustentação, enquanto a micropipeta de injeção, contendo o espermatozóide aspirado, era forçada através da zona pelúcida em direção ao citoplasma, quando um único espermatozóide era injetado após confirmada a penetração.Os oócitos foram examinados aproximadamente 19 horas após a ICSI para confirmação da fertilização. Somente foram considerados fertilizados os oócitos que apresentavam 2 pronúcleos e o segundo corpúsculo polar. Entre 40 e 44 horas após a injeção dos espermatozóides (dia 2), os embriões normalmente fertilizados foram examinados para avaliação morfológica, o mesmo ocorrendo no dia subsequente, isto é, dia 3. Durante este intervalo de tempo, os embriões foram mantidos em meio de cultura a 37°C com CO2, a 5%. No dia 3, os embriões com 6 a 10 células foram submetidos a uma nova micromanipulação, para biópsia e remoção de 2 blastômeros.
Biópsia embrionária e co-cultura dos embriões e blastômeros
O embrião a ser biopsiado era inicialmente transferido para a microgota contendo meio de cultura tamponado (Hepes, Sigma), e levado a microscópio invertido (Leitz, Alemanha), equipado com um par de micromanipuladores mecânicos (Leitz, Alemanha). Cada embrião era imobilizado com uma micropipeta de sustentação em um dos micromanipuladores, através de pressão negativa. Uma vez apreendido o embrião, aproximavase a micropipeta de perfuração (10 a 20 µm), colocada no segundo micromanipulador, contendo solução ácida de Tyrode (pH 2,4), que era delicadamente soprada sobre a zona pelúcida, até que na área de contato fosse formado um pequeno orifício. A micropipeta de perfuração era então afastada e, em seu lugar, a micropipeta de aspiração (30 a 50 µm) era delicadamente colocada junto ao orifício na zona pelúcida. Em todos os casos, 2 blastômeros eram então removidos através de delicada sucção. Todo o procedimento era realizado sob visão microscópica. Em todos os casos biopsiados, a presença de um núcleo em interfase era observado, nos blastômeros isolados, através do microscópio de dissecção. Findo o procedimento, os blastômeros removidos eram colocados em co-cultura com os embriões biopsiados em gotas de 20 µl de meio de cultura, a 37°C e mistura gasosa de 5% de CO2. Alguns blastômeros foram avaliados ainda no dia 3. Os demais, foram mantidos em co-cultura com os embriões até o dia 6, quando os blastômeros diferenciados em células do trofectoderma (TE) foram analisados.Em todos os casos, a avaliação do sexo por PCR era realizada em mais de um blastômeros do mesmo embrião, de modo que houvesse a confirmação do resultado.
Preparo dos blastômeros
Cada blastômero era transferido, através de uma micropipeta, para um tubo de Eppendorf estéril contendo 5 µl de água ultrapura, sob visão direta em lupa (Nikon, Japão) de forma a confirmar a expulsão do blastômero. Os blastômeros eram então mantidos em temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos, e posteriormente, congelados e descongelados antes do processo de amplificação.
Amplificação do DNA por PCR
Dois pares de primers foram utilizados no estudo. Inicialmente, utilizamos o gene determinante testicular (SRY), presente no braço curto do cromossomo Y e amplificando a seqüência Homeobox de 222 pares de base. Posteriormente utilizamos a seqüência do gene codificador para Amelogenina para cromossomos X e Y. Todas as reações constavam das amostras e controle para falso positivo (branco). Inicialmente, o DNA era extraído com temperatura de 95°C em solução de elevado pH. À solução de PCR era acrescida do blastômero para amplificação da seqüência externa (outer). Posteriormente, 2 µl eram aliquotados de cada solução e transferidos para um novo tubo contendo os reagentes para a amplificação da seqüência interna (inner).O número de ciclos para amplificação inicial era de 30 e a segunda amplificação era realizada com 30 ciclos. A análise dos produtos da amplificação era realizadaatravés de eletroforese em mini gel de poliacrilamida a 100V durante 1 hora, corados pela prata.Nos casos em que utilizamos a seqüência do SRY, a célula era considerada como do sexo masculino quando a seqüência específica do fragmento do Y era visível. A ausência desta banda representava uma célula do sexo feminino. Quando utilizamos amelogenina, nos casos de sexo masculino, era possível observarmos a presença de duas bandas (X e Y), sendo que na presença de sexo feminino observamos apenas uma banda (X). Em todos os casos, o procedimento completo levou um tempo máximo de 12 horas.
RESULTADOS
Um total de 50 embriões normalmente fertilizados após ICSI e biopsiados no início do dia 3, foram incluídos no estudo. Em todos os casos, 2 blastômeros foram biopsiados de cada embrião sendo que 7 foram mantidos em co-cultura com os embriões para posterior análise no dia 6. Todos os blastômeros deste grupo apresentaram pelo menos uma divisão celular e diferenciação em célula do trofectoderma (Fig. I). Os demais blastômeros foram imediatamente preparados para amplificação do DNA. Lise celular, decorrente do método de biópsia, foi observada em somente 3 casos, sendo que em todos eles a amplificação ocorreu de maneira normal.
Figura I. Blastômero diferenciado em célula de trofectoderma 3 dias após biópsia e co-cultura in vitro
A primeira série de 10 embriões não pôde ser considerada para análise uma vez tendo apresentado contaminação no controle. Em 15 blastômeros, houve falha completa de amplificação. Os demais 25 blastômeros analisados apresentaram amplificação. A confirmação do sexo observado à análise por PCR foi realizada através da amplificação de outro blastômero proveniente do mesmo embrião, tanto biopsiado quanto multiplicado em co-cultura durante 3 dias. Em 19 casos (76%) os resultados iniciais foram confirmados. Nos 6 casos em que não houve confirmação, 3 foram por falha de amplificação e 3 por amplificações discordantes.
A proporção entre os sexos dos blastômeros amplificados foi de 13 do sexo masculino e 9 do sexo feminino. Em 3 casos houve falha de amplificação e em 3 casos do sexo masculino, o blastômero do mesmo embrião amplificou de maneira discordante. A confirmação da amplificação dos blastômeros do sexo feminino ocorreu em 8 dos 9 casos (89%), no sexo masculino, a confirmação ocorreu em 9 dos 13 blastômeros (70%).
Quando comparamos os resultados obtidos com amplificação de células do trofectoderma, que foram mantidas em cultura por mais 3 dias, com os blastômeros amplificados imediatamente, observamos que em todos os 7 casos de células do trofectoderma a amplificação ocorreu de forma concordante em todos os blastômeros (100% de amplificação), enquanto nos 18 casos de blastômeros indiferenciados houveram 3 falhas de amplificação e 3 situações discordantes (16% de falha de amplificação e 16% de discordância).
Nas células em que foram utilizadas a seqüência de SRY para amplificação observamos um total de 72% de falha (18/25 células). Quando utilizamos a amelogenina, esta taxa de falha foi de 20%, isto é, 3 em 15 células analisadas.
DISCUSSÃO
Nosso estudo demonstra a capacidade de realizarmos diagnóstico genético por PCR em embriões humanos obtidos pela técnica de FIV. A biópsia embrionária seguida de amplificação genética por PCR realizada em um período inferior a 12 horas, permite que os embriões não afetados sejam transferidos no mesmo dia, isto é, dia 3 pós-inseminação, mantendo a rotina de FIV. Realizamos também comparação entre dois primers (específicos para cromossomos X e Y) para amplificação do DNA dos blastômeros e demonstramos, talvez pela primeira vez, a capacidade de diagnóstico genético pré-implantação utilizando células de trofectoderma cultivadas “in vitro”.
A utilização rotineira da técnica de ICSI quando da sexagem de embriões para diagnóstico pré-implantação, impede os possíveis falsos positivos devido à presença de espermatozóides presos à zona pelúcida durante o processo de FIV clássica. Permite também um aumento no número de embriões disponíveis para biópsia, uma vez que a taxa de fertilização apresenta-se superior. Estas conclusões estão de acordo com as recentes análises apresentadas por Verlinsky (1996).
Em nosso estudo, a biópsia embrionária não apresentou efeitos deletérios ao desenvolvimento embrionário estando de acordo com o demonstrado por Handyside et al (1990); Harper (1996) e Soussis et al (1996) após desenvolvimento de gestações com o nascimento de crianças sadias. A presença de lise celular, observada em 3 casos, não interferiu no resultado da amplificação do DNA devido ao fato de representar um dos passos iniciais do processo de PCR, além de não ter havido destruição do material nuclear. Este achado também demonstra a inocuidade do processo de biópsia embrionária para o diagnóstico pré-implantação.
A amplificação do DNA de células do trofectoderma pela técnica de PCR; observada talvez pela primeira vez, representa um avanço considerável no diagnóstico pré implantação, uma vez que permite que se aguarde um período de 3 dias para que as células se multipliquem “in vitro”, aumentando o número de células disponíveis para diagnóstico genético, permitindo que mais de um método seja realizado e diminuindo assim as taxas de erro diagnóstico (Griffin et al, 1994; Ray et al. 1996). Desta forma, embriões biopsiados poderão ser congelados e posteriormente, os não afetados serão transferidos para o útero materno. Outra possibilidade é a transferência em estágio de blastocisto no dia 6 (Bolton et al, 1991).
A presença de contaminação observada em nosso primeiro grupo de estudo, faz parte dos fatores de erro da técnica (Ray & Handyside, 1995) sendo fundamental a sua identificação de modo a impedir falhas no diagnóstico. Esta contaminação, entretanto, é facilmente identificada e corrigida conforme demonstrado pelos resultados obtidos nas séries seguintes. Com relação à falha de amplificação observada em 72% dos casos em que utilizamos o SRY pode ter sido devido ao primer em sí, uma vez que esta taxa foi de somente 20% quando utilizamos a seqüência da Amelogenina. Outros fatores podem ser responsáveis por esta falha de amplificação como a ausência de núcleo nas células biopsiados, falha no método de análise (gel de eletroforese), ou mesmo erros inerentes ao método, uma vez que uma maior porcentagem de falhas de amplificação se deu nas primeiras séries.
A proporção entre os sexos obtidos neste estudo apresentou-se discretamente aumentado para o sexo masculino. Provavelmente, o pequeno número de embriões estudado pode ter sido o responsável por um vício de estudo, entretanto, se eliminarmos os casos em que não houve confirmação do resultado obtido inicialmente, observamos uma proporção mais próxima do esperado, isto é, 8 casos do sexo feminino e 9 do masculino.
O fato de não termos encontrado falha de amplificação ou discordância de diagnóstico quando utilizamos células do trofectoderma demonstra uma alta confiabilidade em seu uso, principalmente se compararmos este resultado com o observado com os blastômeros recém biopsiados (100% e 68%, respectivamente). Entretanto uma avaliação estatística não pôde ser realizada uma vez que o número de células do trofectoderma estudadas foi pequeno. Outra possível explicação para esta diferença, está no fato das células que atingiram diferenciação celular após 3 dias de co-cultura in vitro, certamente apresentarem atividade nuclear, enquanto nos blastômeros recém biopsiados, o núcleo poderia estar ausente.
Em resumo, nosso estudo confirma a possibilidade de biopsiar embriões humanos no dia 3 pós FIV e amplificar o DNA dos blastômeros pela técnica de PCR. Mais ainda, demonstramos a possibilidade de amplificação de DNA em blastômeros multiplicados “in vitro” até a diferenciação em células do trofectoderma, com elevada confiabilidade. Desta forma, poderemos aumentar o número de células disponíveis para diagnóstico genético permitindo análises variadas e maior sensibilidade.