JBRA Assist. Reprod. 2008;12(1):11-14
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2008.12.1.02
Estudo comparativo entre meio GV E HTF/ P1 em fertilização in-vitro
A comparison between GV and HTF/P1 media in IVF in-vitro
Instituto Verhum - Vídeo e Endoscopia e Reprodução Humana QI 03, bloco C, sala 101 - Medical Plaza, Bairro: Lago Sul, Brasília - DF
Resumo
Objetivo: comparar a eficácia dos meios utilizados em fertilização in-vitro para cultivo de embriões humanos.Os meios comparados foram o GV (preparado no Brasil) com os meios fabricados pela Irvine, HTF e P1.
Método: Um estudo prospectivo e aleatório foi realizado em 82 pacientes. Em 41 dessas pacientes foi utilizado meio GV e nas outras 41 foram usados os meios produzidos pela Irvine. As taxas de fertilização, clivagem, gravidez e implantação foram semelhantes com os 2 meios. No entanto observou-se uma tendência a uma maior taxa de implantação com o meio GV (20,7 e 10,71 para os meios GV e Irvine respectivamente), mas não significante. Os meios de cultura fabricados fora do Brasil, passam por severas oscilações de temperatura durante seu transporte e armazenamento. O meio GV, por outro lado, fabricado localmente, pode ser consumido em período de tempo menor e está menos susceptível aos problemas de transporte e manuseio sofridos pelos meios importados. Portanto, considerando os resultados deste estudo, o meio GV se apresenta como uma boa opção para as clínicas brasileiras.
Palavras-chave: meio de cultura, fertilização in-vitro, embriões humanos.
Abstract
Ojective: The aim of this study was to compare the efficacy of culture media used in in-vitro fertilization for cultivate human embryos. The media compared were GV (made in Brazil) and Irvine, HTF and P1 (made abroad). A prospective randomized study was carried out in 82 patients. In 41 patients GV was used and in the other 41, Irvine media were used. Fertilization, cleavage, pregnancy and implantation rates were similar for both groups. Although not significant, a tendency for higher implantation rates was observed with the GV medium (20.70% and 10.71% for GV and Irvine, respectively). Culture media manufactured abroad goes through greater oscillations in temperature during transportation and storage. The GV media, on the other hand, manufactured locally can be consumed in a shorter time span and is not susceptible to the same transportation handling problems faced by the imported media.Therefore, considering the results of this study we believe that the GV medium is a good option for Brazilian clinics.
Key words: culture medium, invitro fertilization, human embryos.
INTRODUÇÃO
Um dos principais fatores de influência no sucesso da fertilização in-vitro tem sido atribuído aos meios de cultivos utilizados (Quinn, 2004). Desde o início da aplicação desta técnica terapêutica, vários tipos de meios têm sido desenvolvidos com a intenção de suprir as necessidades dos gametas e embriões, sempre com o objetivo de incrementar a taxa de gestação (Cooke et al., 2002).
Alguns autores mencionaram que os embriões teriam necessidades metabólicas diferentes de acordo com o estágio de desenvolvimento (Gardner et al., 2000), enquanto que outros relataram que o sucesso estaria associado, exclusivamente, à qualidade dos componentes dos meios (Loutradis et al., 2000). As alterações nas concentrações de glicose e piruvato, além da adição de vitaminas e aminoácidos influenciariam os resultados, como foi preconizada recentemente (Cooke.et al., 2002; Gardner, 1998; Lee et al., 1997). Outros autores entendem que, além dos meios de cultivo, os recipientes utilizados para armazenar essas soluções, são extremamente importantes. (Drury et al., 1996). Por outro lado, pesquisadores têm utilizado suporte de co-cultivo, com diferentes tipos celulares, para melhorar a qualidade do embrião (Seifer et al., 1996).
A duração do cultivo antes da implantação também tem sido discutida exaustivamente e ainda não há completa concordância dos benefícios do cultivo curto (2/3 dias) ou do cultivo estendido até fase de blastocistos (5/6 dias) (Karaki et al., 2002; Schoolcraft & Gardner, 2001).
Independente de sua formulação, os meios de cultura apresentam tempo de vida útil e necessidades próprias para sua preservação. Sugere-se que o tempo de utilização ideal desses meios seja de algumas semanas quando conservados a 4ºC (Quinn et al., 1985). Sabe-se que a importação de meios não garante confiabilidade quanto a sua conservação, além disso, do seu preparo até sua chegada aos laboratórios brasileiros, muitos dias ou até semanas podem ter se passado. O objetivo deste estudo foi comparar os resultados obtidos quando utilizado o meio GV, fabricado no Brasil, com aqueles obtidos ao se utilizar o meio HTF e o meio P1 (Irvine Scientific, USA).
MATERIAIS E MÉTODOS
Após aprovação pelo comitê de ética do Instituto Verhum e assinatura de termo de consentimento esclarecido e informado, 82 pacientes foram incluídas aleatoriamente neste estudo. As pacientes tinham entre 22 a 42 anos de idade e as causas de infertilidade observadas enquadravam-se em: masculina, tubária, múltiplas, outras somente femininas e causas não explicadas.
Após rotina básica de propedêutica, as pacientes iniciavam uso de contraceptivo oral combinado (ACO) contendo 0,15 mg de desogestrel e 0,03 mg de etinilestradiol (Microdiol®, Organon), diariamente, no início do ciclo, por um período mínimo de 19 dias. Para realizar o bloqueio hipofisário, utilizou-se acetato de nafarelina (Synarel®, Zodiac), como agonista de GnRH, através de borrifadas nasais, a cada 12 (doze) horas, alternando as narinas, que tinham início quando faltavam três dias para o término do uso do contraceptivo. Após suspensão do anticoncepcional as pacientes realizavam ecografia transvaginal entre o segundo e quarto dia do ciclo menstrual. O estímulo ovariano era iniciado com FSH recombinante (Gonal®, Serono) ou urinário (Fostimon®, Meizler), em dose que variava de 150 a 300UI/dia, a critério clínico, por um mínimo de sete dias. Novo ultra-som era realizado no oitavo dia de estímulo e iniciado hMG (Merional®, Meizler) suspendendo, então, o uso de FSH. Procediamse a novas ecografias a cada 24h ou 48h, a depender do estágio de crescimento folicular, e quando 2 (dois) ou mais folículos apresentavam diâmetro médio ≥18mm, administrava-se hCG, 10.000UI (Choriomon®, Meizler) ou 6.500UI (Ovidrel®, Serono) em média 35,5 horas antes da captação de óvulos.
As pacientes submetidas ao protocolo com antagonista de GnRH (Cetrotide®,Serono), utilizavam previamente AOC (Microdiol®, Organon), por período não inferior a 15 dias. Ao término da pílula, tendo o exame ultra-sonográfico, feito no segundo dia de sangramento após deprivação, identificado ovários em repouso e endométrio fino (≤ 6 mm), iniciava-se a indução com FSH urinário ou recombinante. Se após ecografia transvaginal de 5º dia de estímulo (sexto dia do ciclo), fosse detectado pelo menos um folículo com diâmetro médio ≥14 mm, iniciava-se o uso de antagonista diário e a aplicação de FSH era substituída por hMG. Administrava-se hCG, 10.000UI (Choriomon®, Meizler) ou 6.500UI (Ovidrel®, Serono) em média 35 horas antes da captação de óvulos, quando dois ou mais folículos apresentavam diâmetro médio ≥ 18 mm.
No momento da captação as pacientes eram randomizadas em dois grupos seguindo a seqüência alternada de captações, utilizando o grupo um o meio HTF/P1 e o grupo dois o meio GV. Os ovócitos captados eram passados, então, para meio GV ou HTF e mantidos em incubadora até o momento da retirada de suas células cumulares. Durante este período o sêmen foi preparado com meio HTF Hepes ou GV Hepes respectivamente para os grupos um e dois.
Três a quatro horas após a captação limpavam-se os ovócitos com pipetas afiladas em diâmetros diferentes, passando primeiramente pela solução de hialuronidase (no máximo um minuto), posteriormente por cinco banhos de HTF-HEPES com 10% SSS (Substituto de Soro Sintético) no grupo um ou, GV-HEPES com 10% SSS no grupo dois. Finalmente, transferiam-se os óvulos para o meio HTF com 10% SSS no grupo um e para o meio GV com 10% SSS, no grupo dois.
Quatro a cinco horas após a captação realizava-se a micromanipulação. A placa era preparada com uma gota central com 5 µl de PVP, acrescentado de 1 µ da suspensão com os espermatozóides e várias gotas de 5 µl em torno com HTF-HEPES com 10% SSS no grupo um e com GV-HEPES com 10% SSS no grupo dois. Os espermatozóides eram imobilizados e injetados nos ovócitos de modo habitual.
Os ovócitos após a injeção eram transferidos para o meio P1 com 10% SSS no grupo um e para o meio GV com 10% SSS no grupo dois e, a seguir, conduzidos para incubadora. Entre 16 horas e 18 horas verificava-se a presença dos pró-núcleos. No segundo dia após a ICSI, transferiam-se os embriões para um novo meio de cultivo P1 com 10% SSS no grupo um e para o meio GV com 10% SSS, no grupo dois.
Iniciava-se o suporte de fase lútea na noite seguinte à coleta dos ovócitos, utilizando progesterona micronizada (Utrogestan®, Farmoquímica), 200mg, intravaginal, a cada 8 horas e realizava-se a transferência dos embriões no terceiro dia após a captação ovular. O número de embriões a serem transferidos dependia da qualidade dos mesmos e, também, da idade da paciente.
A dosagem do β-hCG (gonadotrofina coriônica subunidade Beta) era realizada no 14º dia após a transferência dos embriões, considerando-se gravidez química um resultado de dosagem sanguínea de hCG acima de 50 mUI/ ml e gravidez clínica o encontro de pelo menos um saco gestacional com embrião mostrando batimentos cardíacos, na 12ª semana de gestação. Foram analisadas as seguintes variáveis: média de idade; taxas de fertilização, clivagem, implantação e gestação clínica por transferência; porcentagem de embriões classe I e II obtidos e a média de embriões transferidos por paciente. Os dois grupos foram comparados em relação a essas variáveis pelo teste de Mann-Whitney U Test. Adotou-se o nível de significância de 0,05 (α= 5%).
RESULTADOS
Dos 41 ciclos cultivados em meio GV, 10 foram conduzidos com Cetrotide® e em 31 utilizou-se Synarel®. Dos ciclos cultivados em meio HTF/P1, o bloqueio hipofisário com Cetrotide foi realizado em cinco casos e empregouse Synarel nos 36 casos restantes. A causa da infertilidade nas pacientes em estudo está listada na Tabela I, sendo o fator masculino a principal causa apresentada (54,87% dos casos). Os resultados de taxas de fertilização, clivagem, implantação e gravidez clínica encontramse na Tabela II. Das 41 pacientes que utilizaram GV na fertilização in-vitro, 13 evoluíram para gravidez clínica e no grupo de cultivo com meio HTF/P1, observou-se um total de 11 gestações no montante de 41 ciclos.
Tabela I. Causas de infertilidade das pacientes incluídas no estudo
Tabela II. Estudo comparativo usando meio GV e meio HTF/P1
DISCUSSÃO
Hoje há no mercado diversas formulações de meios para cultivo de embriões, sendo difícil a escolha do meio que corresponda às expectativas dos diversos centros de reprodução humana brasileiros. Infelizmente, as diferentes opções não têm levado a melhores resultados nas taxas de gravidez. Alguns pontos são importantes na escolha do meio de cultura, o que determinaria algumas condutas diferentes nos procedimentos laboratoriais, como a concentração de glicose, fosfato, bicarbonato, presença ou não de glutamina entre outros. A escolha do meio de cultura torna-se difícil, principalmente, porque existem poucos trabalhos recentemente publicados que comparam a eficácia dos diferentes meios nos últimos anos. Em sua maioria, não comparam as taxas de gravidez e implantação, pois transferem, para uma mesma paciente, embriões cultivados em diferentes meios de cultura.
Os meios de cultura P1 (Irvine Scientific, USA) e IVF-50 (Scandinavian IVF Science, Sweden) são usados por diferentes centros de reprodução assistida, sendo, os mesmos, modificações do HTF, com as seguintes diferenças: P1 utiliza gentamicina como antibiótico e IVF-50 utiliza penicilina G; P1 não contém glicose e IVF-50 contém. Em adição, IVF-50 é suplementado com soro albumina e o meio P1 é livre de proteínas, entretanto, contém aminoácidos e taurina. Um estudo realizado por Mauri et al., (2001), comparando esse dois meios após ICSI com cultura até o dia três, não mostrou diferença estatisticamente significante em termos de índices de fertilização, qualidade embrionária e taxas de gravidez e implantação.
Aoki et al., (2005), compararam quatro meios de cultura (HTF; G1.2; Sage Cleavage; Life Global media) usados em fertilização in-vitro até o terceiro dia de desenvolvimento embrionário, observando que as taxas de gravidez, implantação e aborto espontâneo foram similares. Outro estudo comparou os meios comerciais: Global (não seqüencial), P1 e Quinn´s Advantage (não seqüenciais), usados após ICSI até o terceiro dia de cultura, não havendo diferença significativa nas taxas de gravidez clínica e implantação entre os três meios (Moodie et al., 2004).
Comparando estudos com meios que suportam o desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto, pode-se citar o estudo de Langendonckt et al., (2001). A comparação foi entre os meios G1.2/G2.2 e “Sydney IVF cleavage”, os quais diferem entre si pela composição de carboidratos e aminoácidos. Ambos os meios apresentaram resultados similares após transferência no dia 5/6 de desenvolvimento. As taxas de implantação foram 43,1 % e 36,1% para os meios G1.2/G2.2 e “Sydney IVF cleavage”, respectivamente.
Pode-se observar que ainda não há consenso quanto ao melhor meio de cultura a ser utilizado para o desenvolvimento de embriões humanos. Sendo assim, acredita-se que, pelo menos, para o cultivo de embriões até 48-72 h após a fertilização, uma variedade de meios pode ser utilizada, desde soluções balanceadas simples a meios mais complexos, com poucas variáveis nos resultados. Entretanto, para manter o embrião em desenvolvimento in-vitro por mais de três dias, o que permitiria reduzir o número de embriões transferidos e, conseqüentemente, o risco de gestação múltipla, há a necessidade de meios mais complexos.
Os relatos comparando os diferentes meios de cultura, traduzem maior dúvida, ainda, quanto ao melhor meio a ser utilizado. Porém, taxas altas em alguns centros, levam a acreditar que, talvez, fatores como rápido consumo, validade, meio ou condições de transporte influenciem os resultados. Para verificar tais fatores, preparouse meio de cultura no país, considerando que os meios adquiridos comercialmente (habitualmente produzidos no exterior) chegam, tão somente, vários dias ou semanas após sua data de fabricação. O meio em apreço foi denominado GV e foi comparado a outro bastante similar em termos de formulação: o meio HTF. Não foi encontrada diferença estatisticamente significante nas taxas de fertilização, clivagem, gravidez ou implantação. Além disso, foi observada uma tendência a melhores taxas de implantação com o meio GV. O número de casos testados ainda é pequeno, devido à complexidade do procedimento, mas, acredita-se que um número maior de casos pode levar aos resultados com significância estatística.
Karamelagos & Bolton (1999), fizeram estudo comparativo do uso da solução balanceada Earle’s (EBSS) preparada “em casa” com um meio equivalente muito próximo produzido pela Medi-cult (IVF Medium; Medi-Cult, Redhill, Surrey, UK). Os dois meios diferem na composição apenas no suplemento de antibiótico e proteína usados e na concentração de piruvato. Não houve diferença estatisticamente significante nas taxas de fertilização, gravidez ou implantação entre os dois grupos. No entanto, diferença estatísticamente significante entre os dois grupos foi identificada no número de ciclos com falha de fertilização. Observou-se maior falha de fertilização quando os oócitos foram inseminados em meio de cultura Medi-Cult (10/230) quando comparados com os inseminados em EBSS (1/218), apesar de a inseminação com espermatozóides ser aparentemente normal. (Karamalegos et al., 1999).
A maioria dos meios coloca apenas prazo de validade em sua embalagem, muitas vezes não se sabe qual o intervalo de tempo entre o seu preparo e o momento em que chegam ao laboratório de reprodução assistida para serem utilizados. Como não há nenhum produto nacional em produção comercial, e sabendo das dificuldades de importação, acredita-se que os meios cheguem após vários dias ou semanas de sua produção. Mais ainda, é difícil ter certeza das condições de armazenamento. O meio GV foi utilizado por um máximo de 20 dias após seu preparo, acreditando que este seja o fator responsável pelos resultados satisfatórios obtidos, já que, as formulações são semelhantes. Não há dúvida de que a disponibilidade de um meio de cultivo embrionário produzido no Brasil, obedecendo aos rigorosos controles de qualidade, armazenamento e transporte, poderá representar um inestimável ganho no que tange a custo do procedimento laboratorial. Poderá ainda, considerando o reduzido intervalo de tempo entre sua preparação e sua utilização resultar em maior segurança para as pacientes.
Schoolcraft WB, Gardner DK. Blastocyst versus day 2 or 3 transfer. Fertil Steril. 2001;19:259-68.