JBRA Assist. Reprod. 1997;01(02):75-78
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1997.1.2.08
Implantação de um programa de ICSI - Resultados preliminares
ICSI implantation program - Preliminary outcomes
Genesis - Centro de Assistência em Reprodução Humana - Brasília - DF
Resumo
Introdução: A introdução da técnica de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI), no campo da reprodução assistida, permitiu solucionar a maioria dos problemas de infertilidade masculina. Este estudo avalia programa de ICSI em seus 6 primeiros meses e compara resultados com os de serviços já consolidados.
Material e Métodos: Foram avaliados 17 ciclos de ICSI. As indicações com os respectivos números de casos foram as seguintes: oligoastenozoospermia severa (13), azoospermia por agenesia de deferente (1), azoospermia por vasectomia (1) e falha de fertilização em ciclos de fertilização in vitro (FIV) convencional anterior (2). A indução da ovulação foi realizada utilizando protocolo longo com análogos de GnRH na 2ª fase do ciclo e FSH ultra-puro e gonadotrofinas da mulher menopausada (hMG). Após a captação, os oócitos foram identificados e classificados, sendo o complexo cúmulus-corona removido com hialuronidase 40 UI/ml. Em 15 casos, os espermatozóides foram colhidos por masturbação, e através de punção do epidídimo em 2 casos. Na preparação do esperma foram usados gradientes de mini-Percoll nas concentrações de 95%, 70% e 50%. Os espermatozóides foram imobilizados com solução de polivinilpirrolidina 10% (Irvine Scientific). A injeção foi realizada em microscópio Nikon Diaphot 300, equipado com lentes Hoffman e acoplado a micromanipuladores automáticos MM 188 e MO 188 (Narishige, Tokio, Japan).
Resultados: Total de 177 oócitos em metáfase II (MII) foi injetado, obtendo-se taxa de fecundação de 61,0±18,3%, clivagem 93,5%, gravidez por ciclo 38,9%, implantação 16,4% e gestação múltipla de 42,9%. Das 7 gestações, 6 estão em evolução e houve 1 abortamento de uma gestacão trigemelar.
Conclusão: O aprimoramento da técnica de ICSI nos últimos 5 anos, associado a progressiva otimização do equipamento, permite bons resultados preliminares aos grupos iniciantes.
Unitermos: injeção intracitoplasmática de espermatozóides, ICSI, oligoastenozoospermia
Abstract
Introduction: The introduction of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) technique in the human reproduction field solved most of male infertility problems. The authors evaluate an ICSI program in the first six months and compare the results with established services.
Material and Methods: Seventeen ICSI cycles in 17 couples were analyzed. The indications for the procedure were: severe oligoasthenozoospermia (13), azoospermia caused by deferent agenesia (1), azoospermia due to vasectomy (1) and failed fertilization in previous IVF cycles (2). Ovulatory induction was performed with GnRH-a beginning at medium lutheal phase and then using FSH-HP and hMG After retrieval, oocytes were identified and classified. Cumulus-corona complex was removed using hyaluronidase 40 UI/ml. In 15 cases, masturbation was used for sperm collection and epididimal punction in two cases. The semen was prepared using minipercoll (95%, 70% e 50%). PVP was used for sperm immobilization. A Nikon Diaphot 300 equipment with Hoffman lens and automatic MM 188 and MO 188 micromanipulators were used for the injection.
Results: A total of 177 oocytes metaphase II were injected. The normal fertilization rate was 61.0 ± 18.3% with 93.5% of cleavage, 38.9% pregnancy rate per cycle, 16.4% of implantation rate and 42.9% of multiple pregnancies were achieved. A mong 7 pregnancies, 6 are ongoing and spontaneous miscarriage resulted in one triplet case.
Conclusion: The refinement of ICSI in the last five years associated with progressive improvement of the equipment led to good preliminary results for starting groups.
Keywords: intracytoplasmic sperm injection, ICSI, oligoasthenozoospermia
Introdução
Com o primeiro relato de gestação através da ICSI, por Palermo et al. (1992), muitos casos de fator masculino de infertilidade passaram a ser tratados com bons resultados, como oligoastenozoospermia severa e outros com mínimas possibilidades de obtenção de gravidez por FIV. Tournaye et al. (1994) analizaram a aspiração microcirúrgica do epidídimo em 40 homens com agenesia bilateral dos ductos deferentes, obtendo 39% de gestação clínica por ciclo. Tsirigotis et al. (1995) descreveram os primeiros casos de gestação com a técnica de aspiração percutânea do epidídimo. Em 1995, Craft et al. descreveram a técnica de aspiração percutânea de espermatozóides testiculares.
As principais indicações de ICSI são: a) fator masculino severo, principal indicação na atualidade, onde existem menos de 500.000 de espermatozóides com motilidade progressiva no ejaculado, b) azoospermia obstrutiva ou não, onde se injetam espermatozóides do testículo, epidídimo, c) falha ou baixa taxa de fertilização em ciclo anterior de FIV, definida por Lipitz et al. (1994) como menos de 20% dos oócitos fertilizados e d) sêmens valiosos, que normalmente procedem de homens que vão se submeter à radioterapia, quimioterapia ou vasectomia.
Remohí et al. (1996) também indicam ICSI em mulheres com resposta diminuída, onde se recupera menos de 5 oócitos. Nagy et al. (1995a) aconselham em esterilidade por fator imunológico, com a presença de anticorpos anti-espermatozóides. A experiência é fator decisivo, sendo comum começar o programa de ICSI com baixas taxas de fertilização, que melhoram com a prática e a medida que os problemas iniciais vão sendo superados. Svalander et al. (1995) afirmam que é necessário determinada curva de aprendizado para que se alcancem resultados satisfatórios. Remohí et al. (1996) consideram o número de 100 ciclos com 1 000 oócitos injetados o mínimo para se optimizar esta técnica. A Genesis iniciou seu programa de FIV em julho de 1995, e incorporou a técnica da ICSI em dezembro de 1996. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os resultados do programa em fase inicial de implantação e comparar com os de serviços onde a técnica está consolidada.
Material e Métodos
Entre dezembro de 1996 e maio de 1997, foram realizados 17 ciclos de ICSI com 18 transferências em 17 pacientes com idade média de 30,8 ± 4,3 (variando de 25 a 40 anos) e com tempo de infertilidade de 5,4 ±3,6 anos. Previamente ao procedimento, realizou-se pesquisa de HIV, hepatites C e B no casal, e histeroscopia diagnóstica. As indicações para ICSI foram o fator masculino severo (menos de 600.000 espermatozóides recuperados após Percoll), em 13 casos, falha de fertilização em ciclos anteriores de FIV convencional (2), azoospermia por agenesia de deferente (1) e azoospermia por vasectomia (1).
Inicialmente, no processo de estimulação ovariana, foi utilizado o acetato de leuprolide (Lupron, Abbott), 1 mg subcutâneo/dia, iniciando-se entre o 20º e o 24º dia do ciclo menstrual. Após a menstruação, dosava-se estradiol e fazia-se ultra-sonograf ia transvaginal. Quando o estradiol era menor que 50 pg/ml e, em ausência de folículos acima de 10 mm, iniciava-se a estimulação com 225 UI de FSH ultrapuro (Metrodin HP, Serono), por 3 dias e, posteriormente, 225 UI de hMG (Pergonal, Serono), diariamente. No 6º dia, iniciava-se a monitorização com ecografia transvaginal e estradiol sérico, sendo as doses de hMG ajustadas conforme a resposta ovariana.
A gonadotrofina coriônica humana (hCG) era aplicada na dose de 10.000 UI (Profasi HP, Serono) quando 2 ou mais folículos atingiam o maior diâmetro, 18 mm, e o estradiol encontrava-se acima de 300 pg por folículo. Trinta e seis horas após a hCG, procedia-se a captacão dos oócitos através de punção vaginal com agulha Cook Ob/Gyn (Aspiration Needle Set 17G, 28 cm), guiada por ultra-som (Aloka SSD-500, com transdutor vaginal de 5 MHz). Em todos os casos, usou-se o propofol como único agente anestésico. Após a punção, o líquido folicular era encaminhado ao laboratório para a identificação dos oócitos, e examinados sob visão estereoscópica (Olympus ZH10) em placas de cultura (Corning, New York). Em seguida, com auxílio de pipetas Pasteur, eram lavados exaustivamente em meio Gamete-100 (Scandinaviam IVF, Science AB, Goteborg, Sweden) e transferidos para placas de cultura Nunc (Roskilde, Denmark) contendo meio Menezo B2 (Inra Menezo B2, Biomerieux).
Com o término da captação, removia-se o complexo cúmulo-corona, por exposição em hialuronidase, na concentração de 40 UI/ml por 20 segundos, sendo os oócitos completamente desnudados por sucessivas passagens em pipetas Pasteur estiradas ao fogo. Estes foram classificados quanto à maturidade e incubados em estufa (Forma Scientific), com meio Menezo B2, com 5% de CO2, à temperatura de 37ºC, até o momento da injeção. Apenas os oócitos com o 1º corpúsculo polar visível foram injetados.
A ICSI foi realizada em microscópio invertido Nikon Diaphot 300 equipado com sistema de lentes Hoffman (Modulation Opties Ine., Greenvale, NY) micromanipuladores MM-188, MO-108 (Narishige, Tokio, Japan) e placa aquecedora (Fryer A-50, Inc., Huntlet, IL). Os microinjetores usados foram do tipo IM 6 (Narishige, Tokio, Japan).
A microinjeção dos oócitos foi realizada em gotas de 5 µl de Gamete 100, dispostas ao redor de uma gota de polivinilpirrolidina (PVP, Scandinavian IVF Science AB, Goteborg, Sweden) e cobertas com óleo Ovoil 50 (Scandinavian IVF Science AB, Goteborg, Sweden), previamente equilibrado em incubadora. No momento da injeção, uma microgota de amostra seminal, preparada pela técnica de Percoll, foi colocada na periferia da gota de PVP para diminuição dos movimentos espermáticos.
A injeção foi realizada sob aumento de 400X. Cada oócito foi posicionado na micropipeta de fixação (Humagene Fertility Diagnostics, Inc., Charlottesville, VA 22911), com seu corpúsculo polar na posição de 6 horas, e um espermatozóide previamente imobilizado foi injetado dentro do ooplasma com uma pipeta de ICSI (Humagene Fertility Diagnostics, Inc., Charlottesvillel VA 22911), na posição de 3 horas. Após a injeção, a pipeta de ICSI foi delicadamente removida e o oócito liberado. Os oócitos injetados foram lavados e transferidos para gotas de 25 µl de meio Menezo B2, cobertas com óleo Ovoil 50. A avaliação de fertilização foi realizada entre 16 e 18 horas após a microinjeção pela presença de 2 pronúcleos e 2 corpúsculos polares. A clivagem e a classificação embrionária deu-se com 24 horas após a constatação da fertilização, conforme critérios de Conaghan et al. (1993). A transferência foi realizada com cateter de Frydman (Laboratoire CCD, France).
Dessa forma, foram transferidos, em média, 4,1 embriões/paciente (1 a 7). O único caso de criotransferência foi realizado e m ciclo espontâneo, 4 dias após a administração de 5.000 UI de hCG (Profasi, Serono). O suporte de fase lútea foi feito com progesterona micronizada (Utrogestan, Besins Iscovesco, França), com doses que variaram de 300 a 600 mg/dia, iniciando-se no dia da transferência, com duração de 10 dias. No 12º dia, após a transferência, realizou-se o ß-hCG e, quando positivo, a gravidez clínica era confirmada através de ultra-som vaginal pela presença de saco gestacional embrionado, com batimentos cardíacos 5 semanas após a transferência.
Resultados
Dezessete pacientes foram submetidas a 17 punções. Total de 177 oócitos foi injetado: houve taxa média de fertilização normal de 61,0 ± 18,3%, com ruptura de 8 (4,1%). Transferiu-se média de 4,1 ± 1,6 embriões/paciente. As taxas de gravidez por punção e transferência foram de 41,2% e 38,9%, respectivamente. A taxa de abortamento foi de 14,3%. Dos 73 embriões transferidos, 12 implantaram, ocorrendo a taxa de implantação de 16,4% (Tabela I).
Tabela I. Resultados do programa de ICSI
Discussão
A taxa de gravidez por transferência no presente trabalho foi de 38,9%, o que está de acordo com a maioria dos grupos que realizam esta técnica (Nagy, et al. 1995b, Palermo et al. 1993). De 177 oócitos injetados, houve ruptura de 8 (4,1%). Van Steirteghen et al. (1993b), em 7.907 oócitos injetados, tiveram ruptura em 11,5%. Remohí et al. (1996) afirmam que cerca de 10% dos oócitos microinjetados degeneram-se, como consequência dos danos provocados pela pipeta, ou pela introdução de volume excessivo de PVP, enquanto Palermo et al. (1996) assinala taxas menores, em torno de 5,2%.
A taxa de fertilização foi de 61,0%. Em serviços que estão iniciando esta técnica, as taxas de fertilização são, geralmente, mais baixas, até sua consolidação. Van Steirteghen et al. (1991) começaram publicando taxas de fecundação entre 44-65%. Fishel et al. (1994) e Tarlatzis etal. (1994) não superaram 30% em suas primeiras séries. No Brasil, Franco Jr. et al. mostraram taxa de fertilização de 53,6%, em 1995, e de 61%, em 1997. Trabalhos recentes mostram taxas de fertilização ao redor de 75% (Abdelmassih et al. 1996, Aboulghar et al. 1996).
A taxa de implantação foi de 16,4%, comparável a de alguns serviços consolidados (Nagy et al. 1995b; Remohí et al. 1996; Franco Jr et al. 1997). Nossa taxa de gestação múltipla foi de 42,8%, sendo 1 tripla e 2 duplas, seguramente relacionada ao elevado número de embriões transferidos (4,1/paciente). O aumento do número de embriões transferidos leva ao incremento nas taxas de gestação múltipla. Na França, o risco de gravidez múltipla é de 1,4% para 1 embrião transferido, 1,4% para 2, 26,9% para 3, 35,9% para 4 e 41,1% para 5 (FIVNAT, 1993). Jean Cohen (1996) afirma que a maioria dos centros estão preconizando transferir 2 embriões para pacientes com menos de 30 anos com alta taxa de fecundação, 4 embriões para pacientes acima de 40 anos e 3 embriões para as demais pacientes. Van Kooij et al. (1996) mostraram que a transferência de 3 ou mais embriões não melhora a taxa de gravidez, aumentando a taxa de multiparidade em pacientes com menos de 38 anos. Das 7 gestações, tivemos um abortamento em gravidez tripla, e seis encontram-se em evolução.
O aperfeiçoamento da técnica nestes cinco anos, aliado ao desenvolvimento de melhores equipamentos, faz com que grupos que a iniciem tenham resultados satisfatórios. A menor taxa de fertilização evidenciada no presente estudo não alterou os resultados em termos de gestação por punção nos ciclos estudados.
FIVNAT Bilan FIVNAT 1993 - Contracep. Fertil. Sex. 5: 278-286, 1994.