Previsão da formação de blastocistos, uma nova aplicação para biópsia embrionária

S. Geber; M. Sampaio

JBRA Assist. Reprod. 1998;02(03):45-51
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1998.2.3.07

Previsão da formação de blastocistos, uma nova aplicação para biópsia embrionária

New aplicattion for embryo biopsy : the prevision of blastocyst development

S. Geber, M. Sampaio

Correspondência para:
Selmo Geber
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FAX 55-31 2717698 TEL 55-31 2717788
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Resumo
Introdução: Um dos problemas mais importantes, e ainda sem solução, para FIV, é a decisão sobre quais embriões são mais capazes de implantar, e assim deverão ser transferidos.
Material e Métodos: Nosso estudo analisa o desenvolvimento in vitro de blastômeros biopsiados isolados, e compara com o desenvolvimento do embrião de origem, de forma a encontrar uma correlação que poderia demonstrar o potencial de desenvolvimento futuro e elevar as taxas de implantação.
Resultados: Um total de 66 embriões humanos, normalmente fertilizados, foram biopsiados no estágio de 6 a 10 células. No dia 6 pós-inseminação, o número de blastômeros foi contado por marcação nuclear. Um total de 33 embriões atingiram o estágio de blastocisto (50%). Dos blastômeros isolados, 63% apresentaram divisão e 53% cavitação após 3 dias em cultura. Dos blastômeros biopsiados de embriões que se desenvolveram até o estágio de blastocisto, 88% dividiram, 79% cavitaram, 76% dividiram e cavitaram, e 9% não apresentaram divisão ou cavitação; Dos blastômeros biopsiados de embriões que apresentaram bloqueio de desenvolvimento, 39% dividiram (p<0.001), 21% cavitaram (p<0.001), 15% dividiram e cavitaram (p<0.001), e 55% não apresentaram divisão ou cavitação (p<0.001).
Conclusões: Blastômeros biopsiados de embriões que atingiram o estágio de blastocisto apresentaram uma proporção significantemente superior de divisão e cavitação, do que os originários de embriões com bloqueio de desenvolvimento. A cultura de blastômeros isolados pode demonstrar os embriões com maior capacidade de formar blastocistos e maior probabilidade de implantar. A criopreservação dos embriões biopsiados associada à cultura dos blastômeros poderá aumentar as taxas de implantação. Os embriões poderão ser selecionados de acordo com o desenvolvimento dos blastômeros e descongelados para transferência em ciclo posterior.

Unitermos: blastocisto, biópsia embrionária, seleção de embriões, implantação, FIV

Abstract
Introduction: One of the most important and unsolved problems in IVF is to decide which embryos are more suitable to implant and therefore should be transferred.
Material and Methods: We analysed the in vitro development of isolated biopsied blastomeres and compared to the development of the original embryo, in order to find a relationship that could show embryoís potential future development and increase implantation rates.
Results: A total of 66 normally fertilized human embryos were biopsied at the 6- to 10- cell stage. At day 6, blastomeres were counted by nuclear labelling. A total of 33 embryos reached the blastocyst stage (50%). Of the isolated blastomeres, 63% divided and 53% cavitated over 3 days in culture. Of the blastomeres taken from embryos that developed to the blastocyst stage, 88% divided, 79% cavitated, 76% divided and cavitated and 9% neither divided nor cavitated; In those from arrested embryos, 39% divided (p<0.001), 21 % cavitated (p<0.001), 15% divided and cavitated (p<0.001) and 55% neither divided nor cavitated (p<0.001).
Conclusions: Blastomeres biopsied from embryos that reached the blastocyst stage presented a significantly higher proportion of division and cavitation than those originated from arrested embryos. Culture of the isolated blastomeres can demonstrate the embryos with more likelihood to develop to blastocysts stage and that are probably more suitable to implant. Cryopreserving biopsed embryos and culturing blastomeres would increase implantation rates. Embryos can be selected according to the blastomere development and thawed for transfer in a future cycle.

Keywords: blastocyst, embryo biopsy, embryo selection, implantation, IVF

Introdução
Desde o desenvolvimento inicial das técnicas de fertilização in vitro e transferência de embriões (FIV-TE), diversos estudos tem sido realizados com intuito de tentar aumentar as taxas de gestação. Os resultados após FIV-TE variam de ~15% a ~40% de acordo com os protocolos de estimulação, condições laboratoriais e número de embriões transferidos. Alguns estudos demonstraram que o aumento do número de embriões transferidos pode aumentar proporcionalmente as taxas de gravidez (Tan et al., 1990). Este fato, entretanto pode levar a um aumento na incidência de gestações múltiplas (Hershlag et al., 1990) e, consequentemente um aumento nas taxas de morbidade e mortalidade perinatal (Kingsland et al., 1990; Seoud et al., 1992). Outro ponto importante, é o fato de que a transferência de um maior número de embriões pode aumentar a incidência de multiparidade sem aumentar as taxas gerais de gravidez (Svendsen et al., 1996). Assim, é importante aumentar as taxas de gestação sem aumentar as taxas de gestação múltipla, isto é, melhorar as taxas de implantação. Assim, um número reduzido de embriões deveria ser considerado para transferência.
A fim de se reduzir o número de embriões transferidos, é de fundamental importância se ter um critério de seleção bastante eficiente para se identificar os embriões com maior probabilidade de implantar e desenvolver uma gestação. Além disso, é também de grande importância, selecionar os embriões excedentes com capacidade de implantação para posterior criopreservação. Diversos métodos tem sido sugeridos para se avaliar e escolher os embriões a serem transferidos. A avaliação morfológica e de desenvolvimento (Edwards et al., 1984; Cummins et al., 1986; Steer et al., 1992) tem sido utilizada rotineiramente para se excluir embriões com bloqueio de desenvolvimento ou degenerados, com pequeno potencial de implantação. Outros métodos tem sido propostos para avaliar diversos parâmetros metabólicos dos embriões como: gasto de piruvato (Conaghan et al., 1993), consumo de 02 (Magnusson et al., 1986), secreção de fator de ativação plaquetária (O'Neil & Saunders, 1984), e a produção de interleukin-1-alpha (Sheth et al., 1991). Estes métodos entretanto, não tem sido satisfatórios para aumentar as taxas de implantação e gravidez, principalmente quando mais de 3 embriões de boa qualidade (independente do critério utilizado) e semelhantes estão presentes. Assim, a pergunta persiste: quais dos embriões idênticos e de ótima morfologia, ótima taxa de clivagem e de ambiente metabólico adequado deverão ser selecionados para transferência?
O objetivo do nosso estudo é propor um novo método para avaliar a viabilidade embrionária, sua capacidade de desenvolver até o estágio de blastocisto e, provavelmente, implantar e desenvolver normalmente. Nosso estudo analisa o desenvolvimento in vitro de blastômeros isolados, biopsiados no dia 3 pós fertilização, e compara com o desenvolvimento do embrião de origem, em um período de 3 dias em co-cultura, a fim de encontrar uma correlação que possa demonstrar o potencial de desenvolvimento futuro do embrião e aumentar as taxas de implantação. Este é o primeiro estudo que propõe um método invasivo para selecionar embriões para transferência, e demonstra uma elevada correlação com o desenvolvimento embrionário.

Material e Métodos

Indução da Ovulação
Todas as pacientes que tiveram embriões doados para o estudo iniciaram tratamento no 2^o dia do ciclo menstrual com administração de análogo do hormônio liberador das gonadotrof inas (aGnRH) para supressão da função hipofisária. O efeito do análogo era confirmado através da dosagem dos níveis séricos de estradiol (E2) e ultra-sonograf ia endovaginal realizada 10-14 dias após a sua administração. As pacientes eram consideradas prontas para iniciar indução da foliculogênese quando os níveis de E2 encontravamse inferiores a 30 pg/ml e o ultra-som demonstrava uma espessura endometrial inferior a 3 mm.
Após a confirmação da supressão da função hipofisária, iniciava-se a indução da superovulação com injeções intramusculares diárias de gonadotrof inas (HMG). A dose era adequada de acordo com os níveis de E2 encontrados e com o crescimento folicular monitorizado pela ultra-sonografia endovaginal. A gonadotrofina coriônica humana (HCG) era administrada para induzir a maturação oocitária quando 3 ou mais folículos atingiam o diâmetro médio de 17 mm, com níveis de estradiol compatíveis.

Fertilização "in vitro"
A captação dos oócitos era realizada ~34 hs após a injeção de HCG, por aspiração guiada por ultra-som endovaginal. Os oócitos foram inseminados após 5 horas (dia 0) tanto por FIV clássica quanto por injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI). No dia seguinte, isto é, 17 - 19 hs após (dia 1) os oócitos eram examinados para se confirmar a fertilização, através da identificação de 2 pronúcleos. Os embriões foram cultivados em 20 ml de solução balanceada de Earleís com 10% de soro inativado, a 37°C em placa de Petri (Falcon) coberto por óleo mineral (Sigma), a 5% de CO2. Nos dias 2 ou 3 após a fertilização, os embriões eram examinados e, um máximo de 4, eram selecionados para transferência.

Biópsia embrionária
Os embriões normalmente fertilizados e que atingiram o estágio de 6 a 10 células no dia 3 foram transferidos para meio de cultura tamponado em placa de Petri, para biopsia. O procedimento era realizado utilizandose um par de micromanipuladores (Leitz - Alemanha) adaptados a um microscópio invertido (Leitz). Cada embrião era imobilizado por sucção em pipeta de sustentação mantida em um dos maicromanipuladores. O segundo micromanipulador controlava a pipeta de perfuração contendo solução ácida de Tyrode (pH 2.2) e a pipeta de aspiração com meio tamponado. A pipeta de perfuração era colocada em contato direto com a zona pelúcida e um fluxo de ácido era então expelido para proceder um orifício. Esta pipeta era então retirada e a pipeta de aspiração era forçada através do orifício. Posteriormente, um ou dois blastômeros eram removidos por sucção. Em todos os casos, observouse a presença de núcleo em interfase.

Co-cultura de blastômeros e embriões
Os embriões biopsiados e os blastômeros foram cultivados em gotas de 20 ml de meio de Earleís suplementado com 10% de soro materno inativado, sob óleo mineral em placa de Petri a 37°C e mistura gasosa de 5% de C02 em ar. Os embriões e blastômeros foram avaliados diariamente para análise do desenvolvimento até o dia 6.
A formação de cavidade era considerada quando uma quantidade de fluido acumulava-se seja intra ou intercelular entre duas ou mais células. O número de células dos embriões em estágio de blastocisto, e dos blastômeros foi contado pela coloração de Giemsa (BDH) para marcação nuclear.

Análise estatística
Na análise estatística para comparação entre o desenvolvimento dos embriões e blastômeros utilizou-se o teste do qui-quadrado e o de Fisher. Além disso, um modelo de regressão logística foi ajustado para identificar se as variáveis no desenvolvimento dos blastômeros influenciaram o desenvolvimento do embrião até o estágio de blastocisto. Com este modelo foi possível avaliar a probabilidade de formação de blastocisto por cada embrião. A diferença era considerada significante quando p< 0,05. O odds ratio foi calculado para quantificar o grau de associação entre os dois grupos.

Resultados
Um total de 66 embriões normalmente fertilizados e que atingiram o estágio de 6 a 10 células no dia 3 foram biopsiados. Quarenta e quatro embriões tiveram uma células biopsiada, e 22 tiveram duas células removidas.

Desenvolvimento embrionário
Um total de 33 (50%) embriões biopsiados atingiram o estágio de blastocisto nos dias 5 e 6. Vinte e um blastocistos se desenvolveram à partir de 44 embriões que tiveram 1 célula removida (47,7%) e 12 desenvolveram dos 22 embriões que tiveram 2 células removidas (54,5%). Os embriões restantes apresentaram bloqueio de desenvolvimento em estágios anteriores. Dos 33 blastocistos, 16 (48,5%) apresentaram fenômeno de extrusão (hatching) da zona pelúcida no dia 5 (n= 3) ou dia 6 (n= 13).

Desenvolvimento dos blastômeros
Aproximadamente 64% dos blastômeros isolados apresentaram divisão celular em 3 dias de cultura, i.e., 42 de 66. Os demais (24 de 66) blastomeres isolados não se dividiram no mesmo período. Em 33 dos 66 biopsiados (50%) o blastômero isolado apresentou cavitação no período de 3 dias em cultura. Cavitação e divisão simultaneamente foi observado em 30 dos 66 blastômeros biopsiados (45,5%) conforme detalhado na Tabela I.

Tabela I. Comparação entre o desenvolvimento dos embriões biopsiados e dos blastômeros após 3 dias em cultura.

A correlação entre o desenvolvimento dos embriões biopsiados e os blastômeros é descrita na Tabela I. Dos blastômeros retirados de embriões que se. desenvolveram até o estágio de blastocisto, 88% dividiram e 79% cavitaram. No grupo de blastômeros biopsiados de embriões que tiveram bloqueio de desenvolvimento, 39% dividiram e somente 21% cavitaram. Nove por cento dos blastômeros do primeiro grupo e 55 % do segundo grupo, não dividiram nem cavitaram. No primeiro grupo, 76% dos blastômeros dividiram e cavitaram simultaneamente, e no segundo grupo, 15%. Observamos que a proporção de blastômeros, biopsiados de embriões que atingiram o estágio de blastocisto, que cavitaram é significantemente superior àqueles biopsiados de embriões com bloqueio de desenvolvimento (p<0.001). Quando consideramos a divisão celular dos blastômeros, encontramos também uma diferença estatisticamente significante entre os biopsiados de embriões que atingiram o estágio de blastocisto e os provenientes de embriões que apresentaram bloqueio de desenvolvimento (p<0.001). Uma diferença estatisticamente significante também foi observada quando comparamos os blastômeros que cavitaram e dividiram, nos dois grupos de blastômeros - originados de embriões que atingiram estágio de blastocisto e que tiveram bloqueio de desenvolvimento (p<0.001). Quando analisamos os blastômeros que não dividiram nem cavitaram, também encontramos uma diferença estatisticamente significante (p<0.001). Conforme demonstrado na Tabela II, mais blastômeros dividiram, cavitaram e dividiram/cavitaram quando biopsiados de embriões que atingiram o estágio de blastocisto do que aqueles biopsiados de embriões com bloqueio de desenvolvimento. Mais ainda, mais blastômeros não dividiram nem cavitaram quando biopsiados de embriões que tiveram bloqueio de desenvolvimento.

Tabela II. Potencial de desenvolvimento futuro de embrião humano biopsiado no dia 3 de acordo com o desenvolvimento dos blastômeros isolados

Apenas um blastômero cavitou somente (3%) e 4 dividiram somente (12%), nos 3 dias em cultura, no grupo de blastômeros biopsiados de embriões que atingiram os estágio de blastocisto. No outro grupo, 2 blastômeros cavitaram somente (6%) e 8 dividiram somente (24%). Apesar de termos encontrado o dobro de casos no segundo grupo, a diferença não foi estatisticamente significante.
O potencial de futuro desenvolvimento dos embriões biopsiados em estágio de 6 a 10 células foi calculado utilizando-se o Odds Ratio (Tabela II). Embriões cujos blastômeros apresentaram cavitação após 3 dias em cultura tiveram 13,8 vezes mais probabilidade de se desenvolver até o estágio de blastocisto. Embriões cujos blastômeros biopsiados apresentaram divisão celular possuíram 11,1 vezes mais probabilidade de se desenvolver até o estágio de blastocisto. Embriões cujos blastômeros apresentaram tanto cavitação quanto divisão celular tiveram 17,5 vezes mais chance de se desenvolver até o estágio de blastocisto. Por fim, embriões cujos blastômeros não apresentaram cavitação nem divisão celular possuíram 12 vezes mais chance de ter bloqueio de desenvolvimento.
Os dados obtidos também foram analisados com regressão logística para análise de multivariância. Os resultados demonstraram que os fenômenos de divisão celular e cavitação são fatores significantes para predizer a probabilidade dos embriões em se desenvolver até o estágio de blastocisto (Tabela III). De posse destes resultados, fomos capazes de calcular a probabilidade de um embrião se desenvolver até o estágio de blastocisto (Tabela IV). Embriões que tiveram blastômeros biopsiados apresentando divisão celular e cavitação possuíam 81,6 % de probabilidade de desenvolver até o estágio de blastocisto. Quando a cavitação foi o único fenômeno observado, a probabilidade era de 50%; Se a divisão celular foi o único fenômeno observado, 37,5%, e se nenhum fenômeno foi observado a probabilidade era de 11,9%.

Tabela III. Resultados do modelo de regressão logística

Tabela IV. Probabilidade de um embrião desenvolver até o estágio de blastocisto de acordo com o desenvolvimento do blastômero biopsiado

Discussão
É classicamente reconhecido que diversos fatores podem influenciar os resultados de FIV-TE, principalmente no que diz respeito às taxas de gravidez e implantação. Os dois alvos mais importantes para se pesquisar os processos de implantação são o endométrio e a qualidade dos embriões disponíveis para transferência. Para o último, diversos critérios de seleção tem sido propostos (Edwards et al., 1984; Cummins et al., 1986; Magnusson et al., 1986; Sheth et al., 1991; Steer et al., 1992; Conaghan et al., 1993; OÕNeil & Saunders, 1984) para demonstrar os embriões mais aptos a implantar e desenvolver. Tradicionalmente o critério morfológico tem sido mais utilizado, sendo baseado no número, tamanho e forma dos blastômeros, e quantidade de fragmentos anucleados. Tem sido demonstrado que a maioria das gestações resultam da transferência de embriões de boa morfologia e com número de blastômeros esperado. Mesmo assim, somente poucos destes embriões implantam.
Com relação ao estágio de clivagem, já foi demonstrado que no dia 2 pós- inseminação, as taxas de gravidez são significantemente superiores se os embriões estiverem no estágio de 4 células (Trounson et al., 1982; Cummins et al., 1986;Claman et al., 1987;Giorgetti et al., 1995). Estes resultados demonstram haver um ritmo ideal de clivagem após FIV. Com relação à morfologia, embriões com menos fragmentos e sem células de forma irregular possuem maior probabilidade de implantar. Quando analisados todos os parâmetros em conjunto (Puissant et al., 1987; Steer et al., 1992; Giorgetti et al., 1995) existe uma alta correlação com as taxas de implantação. Outros autores relataram que embriões que apresentam clivagem precoce tem um aumento de chances de obter uma gravidez (Shoukir et al., 1997).
Alguns métodos bioquímicos foram utilizados para tentar melhorar os métodos de seleção embrionária. O consumo de piruvato (Conaghan et al., 1993) foi significantemente inferior em embriões que implantaram após transferência nos dias 2 e 3, entretanto, devido a grande variação nos resultados individuais, os autores concluíram que este método isolado é incapaz de ser utilizado para escolher os embriões com maior probabilidade de implantar, sendo o critério morfológico mais consistente. Outro estudo realizado com ciclos naturais (Turner et al., 1994) demonstrou que o consumo de piruvato, isoladamente, não deve ser utilizado como teste definitivo para seleção de embriões para transferência.
Outros métodos de avaliação metabólica e não invasivos foram propostos: consumo de glicose e produção de lactato (Hardy et al., 1989; Lane & Gardner, 1996), consumo de 02 (Magnusson et al., 1986) e ativação do fator de ativação plaquetária (OÕNeil & Saunders, 1984). Estes métodos, entretanto, não demonstraram ser mais efetivos do que o critério morfológico. Um ponto de fundamental importância, e que deve ser sempre lembrado, é como se evitar gestações múltiplas sem reduzir as taxas de gravidez. Alguns autores enfatizaram a necessidade de se aumentar o número de embriões a serem transferidos para se aumentar as taxas de gravidez (Azem et al., 1995). Por outro lado, diversos autores demonstraram que a transferência de dois embriões não reduziu as taxas de gravidez (Waterstone et al., 1991; Englert et al., 1993; Nijs et al., 1993). A transferência de 2 embriões deveria ser considerada para pacientes com bom fator prognóstico, isto é, pacientes jovens e com embriões de boa morfologia, de forma a não reduzir as chances de gravidez em pacientes de mau prognóstico. Neste caso, não existe uma grande dificuldade em se selecionar 3 a 6 embriões para transferência (Shulman et al., 1993) utilizando o critério morfológico. Para as paciente de bom prognóstico, entretanto, não é fácil se selecionar 2 ou 3 embriões entre um grande número de embriões de boa morfologia, uma vez que eles podem ser bastante semelhantes, ou mesmo iguais.
A realização de transferência embrionária no dia 3 pós inseminação, ao invés do dia 2 foi proposta por Dawnson et al. (1995) com objetivo de permitir embriões de boa morfologia se desenvolverem por um dia a mais e, consequentemente, evitar a transferência de embriões com potencial de ter bloqueio de desenvolvimento. Os resultados demonstraram um significante aumento nas taxas de implantação após transferência no dia 3, e baixas taxas de abortamento.
Existe um consenso em se limitar o número de embriões de boa morfologia a serem transferidos de forma a reduzir as taxas de gestação múltipla. Estes números variam de um país para outro mas, idealmente, 2 embriões deveriam ser o limite. Em situações em que diversos embriões com a mesma morfologia e taxas de clivagem estão disponíveis para transferência, um novo método diagnóstico deve ser utilizado para selecionar os embriões com maior probabilidade de implantar. Nosso estudo demonstra que embriões, com a mesma taxa de clivagem no dia 3 pós-inseminação, possuem 50% de probabilidade de apresentar bloqueio de desenvolvimento, confirrnando a necessidade de um novo método de seleção embrionária. Nosso resultados demonstram uma correlação muito importante entre o desenvolvimento dos embriões e dos blastômeros biopsiados. Observamos que embriões cujos blastômeros biopsiados apresentaram cavitação e divisão celular tiveram 17,5 vezes mais probabilidade de desenvolver até o estágio de blastocisto. Mais ainda, fomos também capazes de calcular a probabilidade de um embrião desenvolver até o estágio de blastocisto, isto é, quando blastômeros apresentaram cativação e divisão celular, o embrião tinha uma probabilidade de 81,6% de desenvolver até o estágio de blastocisto.
O congelamento dos embriões não transferidos é um método bastante utilizado para se tentar melhorar as taxas de gravidez sem a necessidade de se repetir a indução da ovulação e a captação folicular (Trounson & Mohr, 1983). Gravidezes tem sido obtidas mesmo utilizando-se embriões biopsiados (Carson et al., 1997). Os resultados, entretanto, não são elevados, e nem todos embriões clivam após o descongelamento (Kondo et al., 1996; Karlstršm et al., 1997). A possibilidade de se predizer o desenvolvimento embrionário poderá evitar a transferência desnecessária de embriões após descongelamento, com pequenas probabilidades de clivar. O desenvolvimento das técnicas de diagnóstico préimplantação (Handyside et al., 1990) permitiu diversos casais com elevada chance de transmitir patologia genética para seus descendentes, de ter seu filhos sem a doença. Também importante, é o fato de que se criar um orifício na zona pelucida (assisted hatching) pode melhorar as taxas de implantação (Cohen et al., 1990). Este parece ser o primeiro estudo publicado que demonstra um mécodo invasivo para predizer o desenvolvimento embrionário e selecionar os embriões mais capazes de implantar após FIV-TE. Neste estudo, demonstramos uma correlação muito alta entre o desenvolvimento embrionário e do blastômero biopsiado. Esta nova técnica pode ser utilizada para selecionar embriões para transferência nos casos em que diversos embriões de boa morfologia são disponíveis. Além disso, podemos avaliar se vale a pena manter os demais embriões congelados. Concluindo, acreditamos que a biopsia embrionária para seleção de embriões para transferencia pode melhorar as taxas de implantação diminuindo as taxas de gestação múltiplas, em ciclos de bom prognóstico.