JBRA Assist. Reprod. 1999;03(01):14-19
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1999.3.1.04
Determinação da qualidade embrionária e correlação com sua taxa de implantação em um programa de reprodução assistida
Determination of embryo quality and correlation with the implantation rate in an assisted reproduction program
Resumo
Introdução: Muitos fatores influenciam as taxas de gravidez durante ciclos de fertilização in vitro, incluindo a etiologia da infertilidade, idade da mulher, protocolos de estimulação, número de ovócitos coletados, número de pré-embriões transferidos e principalmente a qualidade dos mesmos. Este trabalho tem como objetivo avaliar a relação entre a qualidade dos pré-embriões transferidos e a ocorrência de gestações.
Material e Métodos: Foram analizados 351 pré-embriões transferidos para 100 casais que se submeteram as técnicas reprodutivas de fertilização in vitro. Estes casais foram divididos em 3 grupos: No grupo A foram incluídas 60 pacientes onde foi transferido, entre outros, pelo menos 1 pré-embrião de Classe I (64,5%). No grupo B foram incluídas 20 pacientes onde foi transferido, entre outros, pelo menos 1 pré-embrião Classe II, porém nenhum Classe I (21,5%). Finalmente, no grupo C foram incluídas 13 pacientes onde foram transferidos apenas pré-embriões de Classe III, IV e V (14,0%).
Resultados: Nos grupos onde os melhores pré-embriões transferidos foram Classes I e II, as taxas clínicas por transferência foram respectivamente melhores se comparadas com o grupo onde foram transferidos apenas pré-embriões classes III, IV e V.
Conclusão: A taxa de implantação dos pré-embriões transferidos está diretamente relacionada com sua classificação morfológica.
Unitermos: Morfologia embrionária, gravidez múltipla, transferência embrionária, fertilização in vitro, estágio de clivagem
Abstract
Introduction: Several factors have been reported to influence the pregnancy rate during IVF cycles, including the cause of the infertility, age of the woman, stimulation protocol, number of oocytes retrieved, number of embryos transferred and the quality of the embryos. The objective of this work is evaluating the relationship between the embryo quality and the incidence of pregnancies.
Material and Methods: Three hundred fifty one (351) embryos transferred in 100 couples who underwent an IVF program were analyzed. These couples were divided in 3 groups. Group A: 60 patients that received, between all embryos grades, at least one embryo grade I (64,5%). Group B: 20 patients that received, between some embryos grades, at least one embryo grade II, but none grade I (21,5%). Group C: 13 patients that received only embryos Grades III, IV and V (14,0%).
Results: In groups in which the best embryos transferred was grade I and II, the clinical rates per ET were respectively better if compared with the group that received only embryos grades III, IV and V.Conclusion:The implantation rate of transferred embryos is directly correlated with the morphological scoring.
Keywords: embryo morphology, multiple pregnancy, embryo transfer in vitro, fertilization, cleavage stage
Introdução
Diversos fatores podem influenciar as taxas de gravidez em um programa de FIV ou ICSI, tais como a etiologia da infertilidade, idade da paciente, protocolos de estimulação, número de ovócitos coletados, numero e qualidade dos pré-embriões formados e transferidos (Staessen et al., 1992).
Várias técnicas bioquímicas não são utilizadas com o objetivo de prever a viabilidade dos pré-embriões in vitro, mas a morfologia embrionária permanece como o mais prático e confiável indicador de qualidade (Kodama et al., 1995), uma vez que as características morfológicas dos pré-embriões, têm mostrado boa relação com as taxas de gestações nas pacientes submetidas aos métodos de reprodução assistida (Goto et al., 1994).
Outros métodos podem avaliar a qualidade embrionária: avaliação da carga genética, conhecida como diagnóstico pré-implantacional (Veiga et al., 1990) e a análise da atividade metabólica do pré-embrião (Roseboom et al., 1995)
O sucesso da transferência embrionária (medida em porcentagem de gravidez por transferência) aumenta proporcionalmente com o número de pré-embriões transferidos. Entretanto, a transferência de muitos préembriões aumenta consideravelmente o risco de gravidez múltipla gerando riscos tanto para a mãe como para o feto. Diante do fato, o número de pré-embrões transferidos para o útero deve ser limitado e orientado pela qualidade dos mesmos (Gerrity et al., 1988).
Este trabalho tem como objetivo relacionar a qualidade morfológica dos pré-embriões obtidos por fertilização in vitro e/ou ICSI com as respectivas taxas de implantação no útero matemo.
Materiais e Métodos
No período de janeiro a junho de 1996, foram estudados um total de 351 pré-embriões transferidos para 100 casais que se submeteram as técnicas reprodutivas de 44 FIV e 56 ICSI na Unidade de Reprodução Humana do Hospital Israelita Albert Einstein. A qualidade embrionária em ambas as técnicas foi estatisticamente semelhante.
Divisão dos Grupos Estudados
Para melhor avaliação dos resultados separamos as pacientes nas quais foram realizadas transferências intra-uterinas de pré-embriões em 3 grupos: A, B e C. No grupo A foram incluídas 60 pacientes onde foi transferido, entre outros, pelo menos 1 pré-embrião de Classe I (64,5%). No grupo B foram incluídas 20 pacientes onde foi transferido, entre outros, pelo menos 1 préembrião Classe II, porém nenhum Classe I (21,5%). Finalmente, no grupo C foram incluídas 13 pacientes onde foram transferidos apenas pré-embriões de Classes III, IV e V (14,0%).A faixa etária das pacientes variou entre 21 e 43 anos (média etária de 33,3 anos). Nos grupos, esta faixa etária foi distribuída da seguinte forma: no grupo A a idade variou de 21 a 43 anos (média etária de 32,6 anos), no grupo B a idade variou de 25 a 40 anos (média etária de 33,8 anos) e no grupo C a idade variou de 27 a 40 anos (média etária de 33,5 anos).
Hiperestimulação ovariana controlada e coleta dos ovócitos
As pacientes foram submetidas a hiperestimulação ovariana, induzida pela administração de medicamentos hormonais como a gonadotrofina menopausal humana (hMG) - Metrodin ou Pergonal (Serono), a fim de se obter o maior número possível de folículos alcançaram sua maturidade (geralmente 8 a 11 dias após o início da medicação), foi administrada gonadotrofina coriônica humana, Profasi (Serono), via intramuscular com objetivo de induzir a maturação final dos ovócitos. Após 34-35h, os folículos foram puncionados e aspirados sob ultra-sonografia endovaginal. O líquido de 2 ou 3 folículos coletados, foi colocado em tubos de 15 ml contendo cerca de 2 ml de solução tampão fosfatada de Dulbeco e 10 IU/ ml de heparina equilibrada a 37 ºC.
Identificação e classificação dos ovócitos
Os tubos contendo o líquido folicular foram encaminhados, imediatamente ao laboratório de manipulação de gametas, onde eram identificados e classificados de acordo com o grau de manipulação sob microscópio invertido, em aumento de 200 a 400x (Kodama et al., 1995).
Obtencão e preparação do sêmen
As amostras seminais foram obtidas por masturbação após abstinência sexual de 2 a 4 dias. Quando liquefeitos, foram examinados e analisados em câmara de Makler sob o microscópio óptico, quanto à volume, concentração, motilidade e grau de motilidade. A seguir os espermatozóides foram capacitados por dois métodos: Percoll (Mortimer, 1990) ou mini-percoll (Yovich, 1993).
Inseminação dos ovócitos
Para FIV, após intervalo de 3 a 6 hs da coleta dos ovócitos, cerca de 200.000 espermatozóides móveis por ml foram adicionados ao meio de cultura com os ovócitos. Na ICSI, foi injetado apenas 1 espermatozóide por ovócito maduro (MII) após no mínimo 1h de incubação.
Verificação da fertilização
Em um intervalo de 12 a 18 horas após a inseminação os oócitos foram observados sob o microscópio invertido em aumento de 200 a 400x para visualização dos pró-nucleos e avaliação da ocorrência de fertilização (Lewin, 1994).
Determinação da qualidade embrionária
Entre 42 a 44 horas após a inseminação, a clivagem dos ovócitos e consequente desenvolvimento embrionário foram observados em microscópio invertido sob aumento variável de 200 a 400x.Neste momento, a qualidade morfológica dos pr-embriões foi determinada e indicou o número adequado a ser transferido para o útero matemo. Esta determinação seguiu os critérios morfológicos estabelecidos por Veeck (1991).
- Classe I: Pré-embrião com blastômeros de tamanhos equivalentes; sem fragmentos citoplasmáticos.
- Classe II: Pré-embrião com blastômeros de tamanhos equivalentes; com fragmentos citoplasmáticos ou vacúolos em pequenas quantidades.
- Classe III: Pré-embrião com blastômeros de tamanhos desiguais; com poucos ou nenhum fragmento citoplasmático.
- Classe IV: Pré-embrião com blastômeros de tamanhos equivalentes ou não; com fragmentos citoplasmáticos em grandes quantidades.
- Classe V: Pré-embrião com poucos blastômeros e de tamanhos desiguais; completa ou severa fragmentação.
Tansferência para o útero materno
Os pré-embriões foram colocados em catéter de Frydman com uma quantidade mínima de meio de cultivo (10 a 20μ1), com o auxílio de uma seringa tuberculina; este catéter foi introduzido através do orifício cervical até o interior da cavidade uterina, sendo os pré-embriões depositados a 1cm do fundo uterino. Em casos de pré-embriões excedentes, o congelamento foi realizado para possibilitar transferências posteriores, sem novas estimulações e punções foliculares.
Análise Estatística
Os resultados foram analisados estatisticamente por três testes: Teste qui-quadradro de homogeneidade, análise de variância e comparações múltiplas pelo método de Tuke (Bussab et al., 1987).
Resultados
Nas 100 pacientes submetidas à aspiração folicular para FIV, foram identificados de 1 a 32 ovócitos por paciente com um total de 1030 ovócitos. (10,30 ovócitos em média por paciente). A distribuicão da maturidade dos ovócitos está representada na Tabela 1.
Tabela 1. Distribuição da maturidade dos ovócitos identificados
Os ovócitos em métafase II e I (919) foram inseminados pelas técnicas de FIV ou ICSI conforme indicação clínica, resultando em 566 ovócitos fertilizados (61,6%). Deste total, 551 apresentaram fertilização com presença de 2PN (97,3%) e 15 apresentaram poliespermia (2,7%).
Em 93 pacientes, no momento da verificação da clivagem, foram observados um total de 503 pré-embriões (91,3%), dos quais 351 foram transferidos para o útero (69,8%) e os 152 pré-embriões excedentes foram criopreservados (30,2%).
Nas 7 pacientes restantes, não se realizaram as transferências intra-uterinas dos pré-embriões, uma vez que não ocorreu a clivagem embrionária dos ovócitos fertilizados. A distribuição da qualidade dos pré-embriões transferidos ocorreu conforme a Tabela 2.
Tabela 2. Distribuição da qualidade embrionária dos pré-embriões transferidos (n=351)
Os três grpos previamente determinados (A, B e C), contendo as pacientes nos quais foram realizadas transferências intra-uterinas, foram analisados isoladamente conforme as distribuições dos pré-embriões, representados nas Tabelas 3, 4 e 5.
Tabela 3. Distribuição dos pré-embriões transferidos no grupo A (n=60)
Tabela 4. Distribuição dos pré-embriões transferidos no grupo B (n=20)
Tabela 5. Distribuição dos pré-embriões transferidos no grupo C (n=13)
A análise estatística que a média de pré-embriões Classe I transferidos por paciente do grupo A é igual a média de pré-embriões Classe II transferidos por paciente do grupo A é igual a média de pré-embriões Classe II transferidos por paciente do grupo B, porém ambas são diferentes de média de pré-embriões Classes III a V transferidos por paciente do grupo C que apresentou um valor maior. Uma segunda análise demonstrou que a média total de pré-embriões transferidos por paciente nos grupos A, B e C não apresentou diferença estatisticamente significante (p = 0,602). A partir destes resultados foi observado que o número médio de pré-embriões transferidos por paciente nos 3 grupos é semelhante, pórem foram transferidos em maoir quantidade pré-embriões das Classes III, IV e V por paciente.
Em 93 transferências, 22 resultaram em gestações clínicas (presença de saco gestacional à ultra-sonografia com 5 semanas de gestação), obtendo-se uma taxa de gestação por transferência de 23,6%.
Os 351 pré-embriões transferidos (3,7 pré-embriões em média por paciente) geraram 37 sacos gestacionais resultando em uma taxa de implantação total igual a 10,5% No grupo A, a taxa de implantação foi de 13,7%, no grupo B foi de 7,1% e no grupo C foi de 0% (Tabela 6).
Tabela 6. Resultados clínicos dos grupos estudados
Estatisticamente não há diferença, à qualquer nível de significância usual, entre a taxa de implantação do grupo A e B. O nível descritivo obtido entre estes dois grupos foi de p= 0,137. Por ter a taxa de implantação igual a zero, o grupo C não analisado estatisticamente, uma vez que sua diferença é evidente.
Das 22 gestações obtidas, 12 (55,0%) foram únicas (presença de um saco gestacional à ultra-sonografia) e 10 (45,0%) foram múltiplas (presença de mais de uma saco gestacional), estando estas distribuídas entre os grupos A e B (tabela 7). O grupo A apresentou 5 casos de gestação trigemelar e 4 casos de gestação gemelar, sendo responsável por 23 dos 37 sacos gestacionais, enquanto o grupo B foi responsável por apenas 2 dos mesmos. Os 12 sacos gestacionais restantes eram de gestações únicas sendo 9 no grupo A e 3 no grupo B.
Tabela 7. Distribuição das gestações entre grupos.
Discussão
Os resultados do presente estudo demonstraram uma relação direta entre a qualidade dos pré-embriões transferidos e a taxa de implantação. Esta observação coincidiu com estudos de Erenus et al. (1991) que obtiveram uma taxa de gestação significantemente maior quando pré-embriões morfologicamente melhores foram transferidos.
O número de pré-embriões transferidos também é fator importante que influencia os resultados da FIV Neste trabalho foi observado que nos grupos A, B e C não houve diferença entre o número médio total pré-embriões transferidos por paciente. Erenus et al. (1991) demonstraram que a taxa de gestação aumentou e dependeu somente da qualidade embrionária e não do número total de pré-embriões transferidos. De acordo com o resultado obtido, não existe razão para limitar o número de pré-embriões Classes III, IV e V (grupo C) em uma transferência, pois as chances de ocorrer gestações são extremamente baixas. Em casos de transferência com pré-embriões de boa qualidade é sensato limitar o número dos mesmos considerando o prognóstico clínico de cada paciente.
Apesar de uma quantidade maior de gestações múltiplas ter sido observada no grupo A em relação ao grupo B, esta diferença não foi estatisticamente significativa. Contudo, quando comparamos os grupos A e B com o grupo C podemos inferir que a transferência de pré-embriões de melhor qualidade aumenta a taxa de implantação. Puissant et al. (1987) observaram que no momento em que a qualidade embrionária é avaliada por classificação morfológica e re lacionada com os prognósticos das pacientes, fica teoricamente possível selecionar os ciclos que tem uma alta incidência de gestação múltipla.
No grupo C, composto somente por pré-embriões de pior qualidade morfológica, não ocorreu implantação, porém nos outros grupos (A e B) onde estes pré-embriões também estavam presentes, ocorreram gestações. Este dado confere com o estudo de Giogertti et al. (1995) que mostra ser impossível saber quais pré-embriões, em transferências múltiplas, foram re sponsáveis pela implantação. Shulman et al. (1993) concluíram que a taxa de implantação foi significativamente maior quando somente pré-embriões de boa qualidade foram transferidos em relação a transferência de somente pré-embriões de pior qualidade supondo-se assim, que em transferências com pré-embriões de diferentes qualidades, os prováveis responsáveis pela implantação seriam os de melhor qualidade morfológica.
Os sistemas de classificação morfológica trazem a vantagem de ser não invasivos e de execução rápida. A proposta do sistema de análise utilizado foi eliminar a necessidade de quantificar o número de blastômeros, isto é, a consequente velocidade do crescimento embrionário. Concordes com Erenus et al. (1991) não consideramos neste estudo a exata porcentagem de fragmentação embrionária, e sim um critério mais subjetivo de classificação.
Claman et al. (1987) mostraram que sua taxa de implantação permaneceu igual quando pré-embriões com até 30% do volume embrionário preenchido com fragmentos citoplasmáticos foram transferidos. No entanto, concordamos com Plachot et al. (1989) que observaram que a implantação de pré-embriões fragmentados é mais difícil de ocorrer.
Parece claro que vantagens e desvantagens são observadas por cada estudo que procura estabelecer uma re lação entre a qualidade dos pré-embriões e sua taxa de implantação. Entretanto, dificilmente se estabelecerá uma relação exata entre estes parâmetros, uma vez que as transferências obrigatoriamente se fazem com pré-embriões de diferentes qualidades. Parece contudo que a inclusão de pré-embriões de Classes III a V não melhora as chances das pacientes submetidas a FIV ou ICSI.
Referências
Bussab W. O., Morettin P. A. - Estatística Básica: Atual, 1987.