JBRA Assist. Reprod. 1999;03(03):7-13
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.1999.3.3.02
Seleção precoce de embriões após ICSI: Quais são os melhores critérios?
Early embryo selection after ICSI What are the best criteria?
Resumo
Os critérios de seleção embrionária precoce (SEP) foram amplamente discutidos: I- características do oócito e zigoto (ondas citoplasmáticas de granulação; migração, junção e alinhamento dos PN; número e polarização dos nucléolos; halo claro na extremidade citoplasmática). II- clivagem precoce (CP); III-morfologia (blastômeros simétricos, com baixa fragmentação e ausência de multinucleação); IV-Velocidade de clivagem. Os dados da literatura comprovam que é eficiente a SEP após ICSI baseada na CP e na presença de embriões com 4-células. Entretanto, apesar de pouco estudados diversos parâmetros do zigoto também apontam a mesma tendência. A análise da literatura sugeriu que uma somatória de critérios deveria ser utilizada para SEP após ICSI, talvez na forma de um escore gradativo de desenvolvimento, do oócito ao embrião.
Unitermos: oócito e zigoto caracterísitcas, clivagem precoce, velocidade clivagem
Abstract
Early embryo selection (EES) criteria have been extensively discussed. The following EES criteria were studied : I - oocyte and zygote characteristics (cytoplasmic granulation waves; pronucleus (PN) migration, junction and alignment; number and polarization of nucleoli ; a light halo at the cytoplasmic end. II- Early cleavage (EC); III- morphology (symmetrical blastomeres with low fragmentation and absence of mulinucletion); IV - cleavage rate. Literature data have proved that EES after ICSI is efficient when based on EC and on the presence of 4-cell embryos. However, although little studied, parameters concerning the zigote also indicate the sare tendency. Analysis of the literature suggests that the sum of several criteria should be used for EES after ICSI, perhaps in the form of a gradual development score from oocyte to embryo.
Keywords: oocyte and zygoto characteristics, early cleavage, cleavage rate
Introdução
Na maioria dos programas de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) os embriões são transferidos para o útero em estágio de Cl ivagem no 2º ou 3º dia após a coleta dos oócitos, possibilitando dessa forma selecionar embriões supostamente de melhor qualidade.
Entretanto, selecionar embriões para implantação é provavelmente a tarefa mais árdua em reprodução assistida. A qualidade de muitos embriões humanos que são cultivados "in vitro" é deficiente, na maioria das pacientes menos que 20% se implantam depois de transferidos para o útero . Rotineiramente, a seleção de embriões no estágio de 4 a 8 células baseia-se na morfologia e na velocidade do desenvolvimento embrionário, mas muitas vezes os embriões não selecionados são viáveis para implantação. Assim sendo, quais seriam os melhores critérios para selecionar tais embriões ? Alternativas para selecionar embriões com alto potencial de implantação, podem depender de diversos conhecimentos básicos sobre os embriões humanos.
I-Características do oócito e zigoto (ondas citoplasmáticas de granulação; migração, junção e alinhamento dos PN; número e polarização dos nucléolos; halo claro na extremidade citoplasmática). Payne et al. (1997) sugeriram ser o "time-lapse video cinematography" uma excelente ferramenta para estudar a fertilização e o desenvolvimento precoce de embriões. Assim sendo, um total de 50 oócitos humanos foi filmado durante o período de O a 20 horas após a injeção dos espermatozóides no programa de ICSI. De 38 oócitos fertilizados, 92% apresentaram ondas circulares de granulação dentro do ooplasma e descondensação da cabeça do espermatozóide (período 20 a 53 minutos) e extrusão do 2º corpúsculo polar. Habitualmente, identifica-se o pronúcleo (PN) masculino na região central do oócito, pouco antes, ou juntamente, com o aparecimento do PN feminino. Em seguida, o PN feminino migra em direção ao masculino até ocorrer a junção. Posteriormente, o período entre a injeção do espermatozóide e a liberação do 2º corpúsculo polar, formação e junção dos PNs foi correlacionado com a qualidade embrionária no dia 3. Geralmente, embriões de boa qualidade alcançam o desenvolvimento completo dos PN em tempo significativamente mais curto do que os embriões de baixa qualidade. Da mesma forma, o tempo de duração das ondas circulares de granulação tendem a ser maior nos embriões de boa qualidade. Alguns centros realizam a transferência de embriões em estágio pronuclear, quando os genomas originados dos gametas ainda estão fisicamente separados dentro dos respectivos pronúcleos.
Wright et al. (1990) utilizando videotape avaliaram 140 zigotos humanos provenientes de fertilização "in vitro" (FIV) e observaram os seguintes parâmetros : ooplasma, zona pelúcida, forma dos PN, número e distribuição dos nucléolos. Dessa forma, verificaram que os PN aumentaram de tamanho antes da sua migração e os nucléolos inicialmente distribuídos de forma randomizada alinharam-se na parte interna da membrana nuclear porém mantendo seu número constante. Na mesma linha de pensamento, Scott and Smith (1998), sugeriram um escore embrionário baseado nas características do zigoto para identificar precocemente os embriões de melhor qualidade para a implantação. Assim sendo, analisaram de forma retrospectiva 114 pacientes submetidas a FIV que realizaram um total de 92 transferências de zigotos. Uma taxa de implantação de 28% foi obtida no grupo onde foram transferidos zigotos que apresentavam PN juntos ou alinhados, nucléolos distribuídos na junção pronuclear e citoplasma heterogêneo com halo claro na extremidade (fig. 1, 2 e 3), essa taxa foi significativamente maior do que a do grupo com transferência de zigotos que apresentaram ausência de uma dessas características (2%).
Figura I. PN próximos ou juntos
Fig II. Nucléolos alinhados em direção a junção pronuclear.
Fig III. Citoplasma heterogêneo com halo claro na extremidade
Recentemente, Tesarik and Grego (1999), sugeriram um novo critério para seleção de zigotos num estudo retrospectivo de 61 pacientes provenientes de FIV e ICSI. Definiu-se uma classificação de 6 padrões (1 normal e 5 anormais) - (fig. 4, 5 e 6). O padrão normal foi determinado pelas características de zigotos que obtiveram 100% de implantação. O zigoto normal deve apresentar menos que 7 largos "nuclear precursor bodies" (NPB) acumulados na área da junção pronuclear ou mais que 7 pequenos NPB distribuídos randomizadamente em ambos pronúcleos. Em ambos os critérios, não pode ocorrer uma diferença superior a 3 NPB entre os dois pronúcleos. Por outro lado, em um total de 44 transferências embrionárias executadas com pelo menos um embrião proveniente de zigoto com padrão normal foram observadas 50% de gestações. Essa taxa de gestação foi significativamente maior do que a obtida com as transferência de embriões provenientes de zigotos com padrão anormais (9%). Além disso, observouse que embriões provenientes de zigotos normais apresentavam uma menor taxa de interrupção da clivagem e baixa incidência de multinucleação dos blastômeros quando comparados com os anormais. Na mesma linha de pensamento, Conord et al. (1999) analisaram 2 parâmetros de qualidade de 66 zigotos entre 20 a 22 horas do procedimento de FIV/ICSI : 1 - superficie e diâmetro dos PN; 2- número e polarização (migração para a parte interna da membrana nuclear na área de junção dos PN) dos nucléolos de cada PN. Os dados demonstraram diferenças na superficie e no diâmetro dos PN, entretanto, apenas diferenças significantes foram verificadas quanto ao número de nucléolos por zigoto (6.3 versus 8.6; p<0.01 ) e a polarização dos mesmos (53% versus 13%; p<0.05) quando foram comparadas as pacientes grávidas com as não grávidas. Em conclusão, um número diminuído e a polarização dos nucléolos seriam importantes parâmetros na seleção dos zigotos.
FIG IV. Padrão normal
Fig V. Padrão normal
Fig VI. Padrões anormais
II - Clivagem precoce - Geralmente, os zigotos humanos podem alcançar o estágio de 2-células entre 20 a 27 horas após a inseminação. Balakier et al. (1993) avaliaram 978 zigotos humanos provenientes de FIV quanto a presença ou não de clivagem (estágio de 2-células) entre 20 a 27 horas da inseminação. Os dados demonstraram que após 24 horas da inseminação, 5% dos zigotos tinham clivado para o estágio de 2-células, sendo que 38% estavam no estágio 2-células no período de 27 horas após a inseminação. Capmany et al. (1996) avaliando 15 zigotos com 2PN originados de FIV, demonstraram que a primeira clivagem ocorreu entre 25 a 33 horas com média de 28 horas após inseminação.
Por outro lado, Nagy et al. (1994) realizaram uma análise prospectiva do processo de fertilização em casos de ICSI e observaram que após 20 horas da injeção, 68% dos oócitos ferilizados apresentavamse no estágio de dois PN e apenas 10% apresentaram clivagem para o estágio de 2 células.
Shoukir et al. (1997) foram os primeiros que propuseram a seleção precoce de embriões baseada no tempo de identificação da primeira divisão celular. Em estudo prospectivo de 143 ciclos de FIV, a seleção embrionária foi executada pela presença, ou não, da clivagem, no período de 25 a 26 horas da inseminação e definida como clivagem precoce (CP). Nessa ocasião, identificou-se um significativo aumento nas taxas de gestações clínicas (33.3%) no grupo de pacientes que receberam pelo menos um embrião com CP do que no grupo de pacientes que não receberam embriões com CP (14.7%).
Por outro lado, Sakkas et al. (1998) selecionaram os embriões num programa de ICSI pela CP, observada 27 horas após a injeção dos espermatozóides. Um total de 88 ciclos foram estudados (34 ciclos com ausência de CP; 54 ciclos com presenca de CP), obtendo-se uma taxa de implantação e gravidez significativamente maior (p=0.01; p=0.04) no grupo de pacientes que receberam pelo menos um embrião com CP (14% e 25.9%) comparada com o grupo de pacientes que receberam apenas embriões sem CP (3.2% e 5.9%), respectivamente .
Da mesma forma, Platteau et al. (1999) num estudo prospectivo de 146 pacientes provenientes dos programas de FIV/ICSI, selecionaram embriões pela presença de CP, cerca de de 25 horas após inseminação e/ou injeção dos espermatozóides. Os autores relataram um aumento nas taxas de gravidez (24.1 %) e implantação ( 15.7%) no grupo de pacientes que recebeu pelo menos um embrião com CP comparado com (15.9% e 9.5%, respectivamente) o grupo daquelas onde foram transferidos apenas embriões sem CP.
Lundin and Soderlund (1999) usando critério semelhante para seleção embrionária precoce após FIV/ICSI mostraram um aumento nas taxas de gravidez (44.5%) no grupo onde foram realizadas transferências apenas de embriões com CP entre 25 a 26 horas da inseminação/injeção dos espermatozóides em relação ao grupo com ausência de CP (34%).
Jimenez et al. (1999) observaram numa análise retrospectiva de 69 ciclos de FIV/ICSI um aumento significativo (p<0.05) nas taxas de gravidez (48%) e implantação (25.3%) quando foram selecionados embriões com CP após 26 horas de inseminação, em relação ao grupo de embriões sem CP (26.3% e 10%), respectivamente.
Dermican et al. (1999) avaliaram em 102 pacientes, a presença de CP após 27 horas da injeção dos espermatozóides como critério de previsão do sucesso após o ICSI. Os dados relataram que embriões com CP produziram significativamente mais gestações (p<0.005) em relação aos embriões sem CP.
Na mesma linha de pensamento, durante o período de maio a julho de 1999, nosso grupo comparou dois critérios de seleção embrionária precoce. Um escore para zigotos (EZ) foi avalidado em 300 embriões provenientes do programa ICSI, no intervalo de 16 a 18 horas da injeção do espermatozóide. O EZ baseouse na presença de pronúcleos juntos ou alinhados (5 pontos), nucléolos polarizados (5 pontos) e citoplasma heterogêneo com halo claro na extremidade (5 pontos). O EZ ideal atingiria um escore máximo de 15 pontos. Em seguida, observou-se no período de 25 a 26 horas após a injeção do espermatozóide, a presença ou não de CP. Na Tabela I, observa-se que embriões com CP possuem um EZ significativamente superiores (p<0.02) ao apresentado por embriões não clivados. Esse dados confirmam a hipótese de que embriões com CP são frequentemente derivados de zigotos de boa qualidade.
Tabela I. Correlação entre um escore para zigoto (EZ) e a presença ou não de clivagem precoce.
Por outro lado, estudou-se de forma retrospectiva, 114 pacientes submetidas ao programa de ICSI, avaliando-se o poder de implantação de apenas embriões que apresentaram CP durante seu desenvolvimento em cultura (Petersen et al. 1999). As pacientes foram pareadas em dois grupos segundo a idade. No grupo I ocorreram transferências de apenas embriões com CP e no grupo II de somente embriões sem CP. Na Tabela II, estão dispostos os resultados clínicos e laboratoriais das pacientes que receberam apenas embriões com CP versus os obtidos naquelas que receberam apenas embriões sem CP. Na Tabela III, observou-se que a implantação no grupo I foi de 17% sendo estatisticamente superior (0.04) 'aquela obtida no grupo II de 8.9%. Na Tabela IV foi estudada a associação da presença da CP e embriões de 4-células como parâmetros preditivos da implantação embrionária. No grupo com CP mais 4-células , a taxa de implantação foi de 27.4% e de gravidez de 37.5%. No grupo com CP mas sem 4-células, a taxa de implantação foi de 10% e a de gravidez de 14.2%. Na tabela IV calculou-se a sensibilidade, especificidade, eficácia, valor preditivo positivo e negativo desses parâmetros (presença de CP isolada ou associada com embriões 4-células) na previsão da implantação embrionária. A avaliação da CP como parâmetro isolado revelou uma especificidade de 0.69 na identificação do processo de implantação (dia 2), contudo quando associada com a presença ou não de embrião de 4-células, essa especificidade teve um acréscimo de 0.20. Esses dados sugeriram que a seleção embrionária num programa de ICSI com transferência no 2º dia deveria ser baseada na presença da CP e de embrião de 4-células.
Tabela II. Dados laboratoriais e clínicos das pacientes que receberam somente embriões com (grupo I) ou sem a presença (grupo II) de clivagem precoce.
Tabela III. Correlação entre a presença ou não de clivagem precoce e o número de embriões implantados.
Tabela IV. Determinação da sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo da clivagem precoce na previsão da implantação quando avaliada como parâmetro isolado ou associado com a presença de 4-células.
III- Morfologia (simetria, fragmentação e multinucleação dos blastômeros)
Por outro lado, o uso da morfologia e da velocidade do desenvolvimento embrionário é norma nos laboratório de FIV para selecionar embriões no dia 2 ou 3.
Vários trabalhos defendem o aumento das taxas de gravidez e implantação nos programas de FIV quando se selecionam embriões com blastômeros de tamanhos regulares (simétricos) e com ausência ou baixa porcentagem de fragmentação extracelular, (Claman et al. 1987; Erunus et al. 1991 ; Scott et al. 1991; Staessens et al. 1992 e Sluman et al. 1993). Da mesma forma, a multinucleação nos blastômeros (MB) tem sido correlacionada com baixas taxas de gravidez e implantação, (Jackson et al. 1998). Embriões de baixa qualidade morfológica ou com parada no desenvolvimento em cultura apresentam alta incidência de MB (Munné & Cohen. (1993) e Munné et al. 1994). Entretanto, a presença de tais defeitos nucleares também tem sido encontrada numa incidência relativamente alta (15%) em embriões de 2- e 4- células porém com boa qualidade morfológica. A presença de MB em embriões de 2- células é significativamente maior do que em embriões de 4- células, sugerindo que uma alta porcentagem dos embriões humanos se tornam anormais durante a primeira divisão meiótica (Balaker and Candesky 1997). Por outro lado, Kligman et al. (1996) usando técnicas de hibridação "in situ" por fluorescência demonstraram que 75% dos embriões com MB, examinados no dia 2 e 3, apresentaram anomalias cromossômicas quando comparados com 32% dos embriões com ausência de MB. Em conclusão, esses trabalhos sugeriram que embriões com presenca de MB não parecem ser viáveis para a transferência, e que a presença ou não de MB, pode ser um importante fator na seleção embrionária precoce.
IV- Velocidade de clivagem - Desde há alguns anos, Testart (1986), analisou a velocidade da clivagem como parâmetro único na selecão de embriões, demonstrando que embriões com maior poder de implantação possuem uma velocidade maior de clivagem.
Lewin et al. (1994) analisaram 197 ciclos de FIV relatando um taxa de gravidez (22.2% versus 16.2%; p < 0.05) e parto (7.1% versus 4.1%; p<0.001) significativamentes maiores quando a transferência de embriões foi executada com 4 ou mais células (42 a 44 horas da inseminação) em comparação com embriões com 2 ou 3-células.
Em 1995, Giorgetti et al. analisaram 957 transferências no dia 2 de apenas um embrião proveniente de FIV observando a influência nas taxas de implantação e parto de 4 parâmetros morfológicos : clivagem, embrião de 4-células, irregularidades dos blastômeros e fragmentação. Os embriões de 4-células implantaram 2 vezes mais do que embriões mais lentos ou mais rápidos. Na mesma linha, Ziebe et al. ( 1997) estudaram retrospectivamente a relação entre morfologia, clivagem e as taxas de implantação de 1918 embriões provenientes de FIV, e confirmaram a superioridade em implantar dos embriões de 4-células. Por outro lado, a baixa quantidade de fragmentação extracelular não afeta o poder de implantação dos embriões de 4-células quando comparados com os de 2-células porém com ausência de fragmentação.
Jhu et al. (1997) num estudo retrospectivo de 455 embriões transferidos após ICSI, demonstraram um aumento na taxa de gravidez de 9.3% para 35.8 % quando pelo menos um embrião com mais de 2-células foi transferidos no dia 2.
Do mesmo modo, Cullinan et al. (1999) filmando 201 embriões no período de 42 a 48 horas após a inseminação, demonstraram que no grupo das pacientes em que implantaram 100% dos embriões, 84.6% dos embriões eram de 4-células. A porcentagem de embriões de 4-células diminuiu para 66.6% quando implataram 2 de 3 embriões, para 56.3 % quando implantaram 1 de 2, e para 44.4% quando implantaram 1 de 3. Em conclusão, embriões de 4-células no dia 2 tem maior poder de implantação em relação aos embriões com mais ou menos células.
Por outro lado, nosso serviço adotou dois critérios de seleção para a transferência de embriões no dia 2: CP e 4-células. Um total de 54 pacientes foram pareadas por "matching" segundo a idade e divididas em 3 grupos (18 pacientes cada) : grupo I (pacientes com ausência de implantação de todos os embriões transferidos); grupo II (pacientes com implantação = 50% dos embriões transferidos); grupo III (pacientes com implantação de 100% dos embriões transferidos). Na Tabela V, observou-se um aumento da frequência (32%, 51 %, 75%) de embriões com CP e 4-células a medida que aumentaram as taxas de implantação, entretanto esse fato não ocorreu (22%, 23%, 21%) quando se observaram embriões com ausência de CP e 4-células. Os dados comprovaram a importância da utilização da somatória de critérios de seleção embrionária no 2º dia. Quais os melhores critérios para selecionar precocemente os embriões após ICSI? Na verdade uma somatória de critérios deveria ser utilizada, na forma de um escore gradativo de desenvolvimento, do oócito ao embrião, onde os seguintes parâmetros deveriam ser incluídos : I. Características do oócito e zigoto (ondas citoplasmáticas de granulação ; migração , junção e alinhamento dos PN, número e polarização dos nucléolos, halo claro na extremidade citoplasmática); II. clivagem precoce; III. morfologia (blastômeros simétricos, com baixa fragmentação e ausência de multinucleação); IV. Velocidade de clivagem (presença de 4-células no 2º dia ou 8-células no 3º dia).
Tabela V. Correlação entre taxas crescentes de implantação embrionária no dia 2 e embriões de 4-células que apresentaram ou não clivagem precoce (CP).