JBRA Assist. Reprod. 2001;05(03):125-128
ATUALIZAÇÃO
doi: 10.5935/1518-0557.2001.5.3.08
Atualização sobre meio de cultura
Culture media: review
Resumo
Os Meios de cultura devem estabelecer para os embriões condições similares àquelas obtidas na trompa e no útero. A revisão procura mostrar, quais são os meios mais comuns usados em fertilização "in vitro", simple, sou complexa. Os componentes são discutidos.
Key words: culture media, ICSI
Abstract
Culture media should enable "in vitro" embryos to have a condition similar to the physiology of the fallopian tubes and uterus. This review take a look at today most common media used in IVF, simple or complex ones. The componentes are discussed.
Unitermos: meio de cultura, ICSI
Introdução
Todo esforço investido em pesquisas sobre novos meios de cultura tem como objetivo permitir que o embrião tenha, "in vitro", condições de cultura que sejam o mais semelhante possível ao ambiente fisiológico das tubas e do útero. Leese (1998), em seu trabalho "Human embryo: back to nature" ressaltou que os meios utilizados para embriões humanos foram desenvolvidos a partir de meios para cultura de células somáticas, que têm exigências nutricionais e se desenvolvem em ambiente muito diferente do ambiente das tubas e útero. Segundo ele, a composição química dos meios de cultura deveria ser baseada na composição do trato reprodutivo feminino. Os meios de cultura comercialmente disponíveis não apresentam a composição química exata de seus elementos isto é, sabemos quais são os compostos químicos mas não sabemos a concentração de cada componente. Esta última informação é considerada como sigilo comercial. Tal fato dificulta o estudo acerca das concentrações ideais de cada elemento em estudos comparativos utilizando diferentes meios de cultura. Os meios de cultura utilizados em fertilização assistida variam grandemente em sua composição química, embora haja pouca diferença entre eles na habilidade em sustentar o desenvolvimento "in vitro" dos embriões humanos, bem como na taxa de gestação obtida. Este fato tem levado a grande confusão com relação à formulação dos meios de cultura e no papel de cada componente no desenvolvimento do embrião. Estudos das necessidades metabólicas e das secreções do trato reprodutivo feminino tem demonstrado que os meios de cultura em geral, fornecem substratos de energia e outros componentes em concentrações maiores do que as realmente necessárias.
Condições de Cultura
O sucesso da fertilização "in vitro" muitas vezes está comprometido por condições sub-ótimas de cultura que gera embriões com baixa viabilidade. A otimização do desenvolvimento "in vitro" não está relacionada apenas ao melO de cultura mas também é afetada por parâmetros físicos como condições de incubação e presença de células somáticas na cultura. Por isso, o mais apropriado é considerar melhorias no sistema de cultura de embriões como um todo mais do que os meios de cultura isoladamente.
Quando fazemos uma análise comparativa das condições de cultura no ambiente fisiológico verso "in vitro" nos deparamos com pelo menos duas diferenças importantes:
a) "ln vitro" os sistemas deculturanão mimetizam as condições ambientais do trato reprodutivo feminino. Temos então, um ambiente artificial onde o volume de meio utilizado, em geral, de 1,0 ml, é muito maior do que o volume de tluido que está em contato com o embrião, que é da ordem de microlitro!. Desta forma, os fatores autócrinos encontram-se muito diluídos ou então não atuantes. Este problema pode ser contornado com técnicas de microgotas, onde os embriões são agrupados em gotas que variam de 5 a 50 microlitros.
b) "ln vitro" os embriões também não estão sob ação dos fatores parácrinos. Ao contrário do que ocorre no trato reprodutivo, o embrião nos sistemas de cultura está exposto a um ambiente estático, na maioria das vezes exposto a um único meio por todo período de incubação. Poroutro lado, o embrião sofre modificações no seu metabolismo exigindo nutrientes diferentes em cada etapa. Uma alternativapara solucionar este problema foi o surgimento de meios seqüenciais, lembrando que o embrião humano requer alta exigência nutricional, assim como os embriões dos mamíferos em geral, pois o oócito não possui estoque de substância de reserva, sendo necessário retirar do meio os nutrientes.
Composição Química dos Meios de Cultura
O conhecimento da composição química dos meios de cultura é fu ndamental, pois esses dados irão auxiliar no desenvolvimento "in vitro" desde a captação até o momento da transferência, fornecendo ao embrião os nutrientes necessários. A composição química básica de um meio de cultura inclui: água, íons, substratos energéticos e sistema tampão. Alguns elementos podem ou não ser acrescentados, tuis como: fonte de proteínas, aminoácidos, vitaminas, hormônios. Cada componente desempenha uma função própria.
Água - Maior componente do meio, cerca de 90%, como nos tecidos vivos, com alto grau de pureza, livre inclusive de pirogênios.
Íons - São os responsáveis pela osmolaridade do meio, ou seja, a concentração dos íons vai determinar a pressão osmótica do meio. Sua composião nos meios de cultura é muito variável e pouco se sabe a respeito do papel de cada um deles. É muito difícil interpretar os efeitos de um único íon. Estudos mostram que embriões de camundongos são capazes de se desenvolver nas mais diversas concentrações de um mesmo íon. Por exemplo, o potássio de 0,4 a 40mM, o magnésio de 0 a 9,6mM e o cálcio de 0,1 a 10,2mM (Bavister et al, 1989).
Substratos de Energia - São macromoléculas que quando quebradas liberam energia que a célula utiliza para suas reações químicas. Os requerimentos energéticos do embrião humano pré implantado ainda necessita ser totalmente determinado. O embrião humano utiliza preferencialmente o piruvato até o estágio de mórula, enquanto que a glicose passa a ser a fonte principal de energia a partir do estágio de blastocisto. Muita discussão existe sobre a concentração e a presença da glicose nos meios usados nos estágios iniciais do desenvolvimento do embrião humano. Também em relação a este componente, observamos grande variação nas concentrações encontradas nos meios quando comparadas às concentrações fisiológicas nas tubas e útero.
Proteínas - Atuam como fonte de nitrogênio e como quelante de íons metálicos tóxicos. Essas moléculas ligam-se aos íons metálicos, retirando-os do meio. A presença de proteínas no meio facilita o manuseio dos embriões na cultura, pois evita que colem no fundo da placa. Em geral, a origem desta proteína é do soro humano ou albumina adicionado ao meio de cultura. O problema é que estes elementos carreiam marcromoléculas agregadas como hormônios, vitaminas, ácidos graxos, pirogênios, além do risco da transmissão de patógenos.
Aminoácidos - Os embriões de camundongo mantém um pool endógeno de aminoácidos e possuem um sistema específico de transporte desses elementos durante o seu desenvolvimento. Além disso, os fluidos das tubas e útero apresentam quantidade significante de aminoácidos livres, o que parece indicar que os aminoácidos têm um papel fisiológico importante no período pré e peri-implantação. Os oócitos humanos possuem no seu citoplasma RNAs, ribossomos e aminoácidos que serão usados pelo embrião para sintetizar as proteínas necessárias ao seu metabolismo nos estagios iniciais (até 8 células). Por isso, não há necessidade de aminoácidos nos meios utilizados até o dia 3 de cultura. A partir de 8 células, o embrião humano tem seu material genético ativado, já usou o aporte de aminoácidos do citoplasma e precisa retirar aminoácidos do meio. Considerando este fato, os aminoácidos deverão estar presentes nos meios complexos usados a partir do dia 3 de cultura. É importante observar que o metabolismo dos aminoácidos libera amônia no meio. Desta forma, meios que possuem aminoácidos precisam ser trocados a cada 48 horas.
Vitaminas - Embora estejam presentes nos meios complexos, seus efeitos ainda são desconhecidos. Os embriões são capazes de se desenvolver até blastocisto em ausência de vitaminas.
Sistema Tampão - Deve ser incluído em meios onde ocorrerá manipulação dos oócitos ou dos embriões. Sua função é manter o pH do meio. O tampão fisiológico é o bicarbonato de sódio, uma vez que é encontrado no fluido que circunda as células de mamíferos. Entretanto, a maior desvantagem é a rápida alteração de pH quando a cultura é exposta ao ar ambiente, pois é um sistema dependente de concentração de CO2 em tomo de 5%. O tampão HEPES é o que tem sido usado nos meios de cultura, pois não necessita de CO2 para manter o pH constante. Existem condições a respeito da possibilidade de toxidez do Hepes. Entretanto, é possível conseguir desenvolvimento completo de embriões de camundongo na presença deste tampão.
Fatores de Crescimento - Os fatores de crescimento têm sido muito pesquisados e parece que eles atuam estimulando a mitose e a síntese de proteínas em blastocistos de camundongos. Como os embriões humanos em geral são transferidos nos dias 2 ou 3, não parece que seja essencial a presença desses elementos no meio.Os meios de cultura são classificados em dois grupos: simples e complexos. Os meios simples foram desenvolvidos a partir de meios usados para cultura de embriões de camundongos, contendo apenas sais e substratos de energia, porém alguns meios simples já vem suplementados com proteínas enquanto outros, necessitam de suplementação. Os meios complexos foram desenvolvidos a partir daqueles utilizados paraculturas somáticas e apresentam maior número de componentes, tais como: aminoácidos, vitaminas, precursores de ácidos nucléicos e substrato de energia. Da mesma forma que os meios simples, os meios complexos podem também ter ou não suplemento protéico.Na verdade, devido a grande variedade na composição química dos meios de cultura e da falta de informação concreta das verdadeiras concentrações destes componentes usados nos meios, é muito difícil identiticar o grau de importância de cada componente durante todo o desenvolvimento embrionário levando a uma série de contradições em relação a formulação de um meio de cultura. ideal. Os estudos das necessidades metabólicas e das secreções do trato feminino tem demonstrado que os meios de cultura fornecem substratos de energia e outros componentes em excesso.
A tabela I, exemplitica a variação observada nas concentrações de alguns componentes em meios conhecidos (HTF, HAM, MENEZO), comparando-os com as concentrações encontradas nas tubas, útero e soro humanos.
Tabela I. Componentes químicos em meios naturais e artificiais
As maiores controvérsias dizem respeito ao substrato de energia utilizado nos meios, ou seja, glicose e / ou piruvato. O outro ponto de discussão é a necessidade das proteínas. Quanto à concentração de glicose nos meios alguns trabalhos com embriões humanos mostram resultados controversos. Conclusões definitivas são difíceis de serem conseguidas pois muitos estudos não são prospectivos e randomizados, incluem poucas pacientes ou utiliza combinação de meios de cultura. A maioria dos estudos sistemáticos usados para verificar o desenvolvimento de embriões em meio de cultura, utilizando ou não glicose, tem sido realizados em embriões de roedores (camundongos e hamsters). Estes estudos demonstram ser a glicose tóxica para o desenvolvimento inicial de alguns embriões. Na espécie humana, entretanto, há o consumo de alguma glicose nos estágios iniciais do desenvolvimento (formação de 2PN) e mais tardiamente na transição entre mórula e blastocisto.
Recentemente, Coate et al., 1999 em um estudo prospectivo e randomizado constataram que os embriões de fertilização "in vitro", cultivados em meio sem glicose tem maior número de blastômeros e melhor qualidade. Não foi observada, poróm, alteração significativa nas taxas de implantação e gravidez quando comparadas aos embriões cultivados em meio com glicose. Baseados nestes dados os autores recomendam a redução na concentração da glicose nos estágios iniciais de desenvolvimento (entre 2PN e 4 a 8 células).
Devreker. et al., 2000 avaliaram oconsumode glicose e piruvato desde a formação de 2PN até a 2a divisão (dia 2 de cultura). Os ensaios metabólicos para esta análise precisam se realizados em baixas concentrações de glicose. Inicialmente testaram a habilidade do meio de cultura EBSS (Earle's balanced salt solution) com baixa concentração de glicose (1,0 mM) em sustentar o desenvolvimento inicial de embriões humanos., " Os zigotos resultantes de ICSI foram distribuídos randomicamente em meio com glicose a 5,56 mM e 1,0 mM. Os parâmetros avaliados foram: taxa de fertilização, taxa de clivagem e número de células no dia 2 de cultura. Os resultados demonstraram que não houve diferença estatisticamente significativa entre os embriões cultivados nas duas concentrações de glicose. O resultado das análises metabólicas mostraram pela primeira vez que: o consumo de glicose desde o estágio de 2PN até 4 células não é detectável, sinalizando que este componente pode ser dispensado da formulação de meio de cultura ideal. Quanto ao piruvato, foi detectado o consumo maior durante o estágio de 2 PN e nas primeiras divisões, provavelmente porque as modificações pelas quais o zigoto passa durante este período sejam dependentes de energia, conseguida através da quebra da molécula de piruvato.
Os meios de cultura normalmente possuem albumina humana ou bovina como fonte de proteína. Quando estes não estão presentes, normalmente é realizada uma suplementação no meio, visto que a eficiência do meio contendo tanto albumina humana quanto a bovina é similar. O uso de meio de cultura com proteína obtida de doador apresenta, no entanto, risco potencial em transmitir doençaspara pacientes em tratamento de reprodução assistida. Alguns estudos procuram avaliar a real necessidade de se ter proteína no meio de cultura.
Ali et al., 2001 avaliaram se a ausência de proteína no meio de cultura alteraria o desenvolvimento de embriões humanos até o dia 2. Primeiramente, foi criado um meio denominado ART-7 totalmente desprovido de proteína, apresentando somente em sua composição sais, aminoácidos, antioxidantes e vitamina. Este meio foi testado em embriões de camundongos no estágio de 1, 2 e 4 células; 80% destes embriões chegaram a blastocisto. Em seguida, o meio foi testado em embriões humanos de 1 e 3 PN, tendo como resultado 95,8% dos embriões com 8 células após 24 horas em cultura. Foram realizados ainda dois testes comparando o meio ART- 7, com IVF-50 e com MEDICULT utilizando embriões humanos para ICSI. Como resultado, foi observado que os embriões cultivados no ART-7 eram de melhor qualidade em relação aos cultivados nos outros dois meios. Embora esta diferença não tenha sido estatisticamente significativa, a ausência de proteínas não parece afetar o desenvolvimento embrionário humano.
Em contrapartida, Devreker et al (2001), publicaram um estudo sobre meio de cultura suplementado com aminoácidos para verificar possíveis benefícios que estes poderiam trazer ao desenvolvimento do embrião. Portanto, 129 embriões foram randomicamente distribuídos em três meios de cultura: (1) Earle com glicose e glutamina (controle), (2) Earle com glicose e 20 aminoácidos e (3) um meio de cultura comercial COOK (K- SCIM) + 20 aminoácidos. Como resultado deste experimento, veriticou-se que não houve diferença significativa quanto a qualidade dos embriões formados, quanto ao percentual de desenvolvimento até blastocisto, quanto ao percentual de embriões com 8 células no dia 3 de cultura e quanto ao percentual de blastocistos expandidos. Porém, a análise do número de células dos blastocistos formados nos diferentes meios de cultura, mostrou que: nos meios com aminioáciodos o número médio de células era maior (100 células) do que no meio sem aminoácidos (61 células). A suplementação do meio de cultura com aminoácidos, após o dia 2 de cultura, aumenta significativamente o número de células dos blastocistos formados, embora o aspecto dos blastocistos seja semelhante nos meios com ou sem aminoácidos.
Mesmo com todos os estudos já realizados, ainda não é possível obter uma conclusão segura de como os componentes dos meios e suas concentrações realmente influenciam no desenvolvimento embrionário desde a captação até a transferência. Além de não termos acesso às concentrações de cada componente químico existente nos meios de cultura comercializados, não é observado diferença significativa na qualidade embrionária em meios com ou sem glicose, ou com ou sem proteína, entre outros, nos levando a concluir que a morfologia é um critério pobre ou falho para medir a capacidade do meio de cultura em produzir embriões viáveis. É provável que apesar das condições de cultura serem consideradas como ideais, possam se desenvolver embriões anormais (Ie 3PN), com uma ótima morfologia (G I - sem fragmentação e blastômeros regulares) tanto quanto embriões normais (2PN) que interrompem seu desenvolvimento ou ainda se apresentem um morfologia ruim (G3 / G4 - com fragmentação >20% e blastômeros irregulares). Sugere-se que os estudos com os meios de cultura continuem atim de se chegar a um meio ideal, seja ele totalmente sintético ou não.
Leesse H. J - Human Embryo Culture: Back to Nature. J. Assis. Reprod. Gen., 15:8 p. 466, 1998.