JBRA Assist. Reprod 2006;10(1):11-16
ARTIGO ORIGINAL
doi: 10.5935/1518-0557.2006.10.1.03
Características Histológicas, Presença ou Não de Espermatozóides na Biópsia Testicular Correlacionadas ao Padrão Hormonal de Pacientes Azoospérmicos
Histological Characteristics, with Presence or Absence of Spermatozoa in Testicular Biopsy, Correlated with the Hormonal Pattern of Azoospermic Patients
1Centro de Pesquisas do Hospital de Clínicas de Porto Alegre
2Setor de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre
RESUMO
O objetivo deste estudo foi o de avaliar a concentração de gonadotrofinas hipofisárias, a histologia testicular e o achado de espermatozóides móveis ou imóveis na biópsia testicular de pacientes azoospérmicos, estabelecendo uma correlação entre estas variáveis.Este foi um estudo transversal retrospectivo que analisou a integridade histológica de 27 pacientes azoospérmicos, que foram divididos em dois grupos, os vasectomizados (n=11; 40,7%) e os não vasectomizados e com histórico de infertilidade (n=16; 59,3%). A análise classificou os achados histológicos em 4 categorias conforme o máximo desenvolvimento celular atingido:1- hialinização total do epitélio; 2- presença apenas de células de Sertoli; 3- presença de espermatócitos primários; 4- presença de espermátides alongadas. As biópsias foram classificadas quanto ao achado de espermatozóides em três grupos: presença de espermatozóides móveis, presença de espermatozóides imóveis e ausência de espermatozóides.Os pacientes foram submetidos a dosagens hormonais de FSH, LH, prolactina e testosterona total. Os níveis séricos de FSH nos quatro grupos de pacientes classificados quanto à população celular na biópsia, foram significativamente diferentes. Da mesma maneira, o achado de es permatozóides na biópsia também foi correlacionado com a concentração de FHS. Este trabalho reitera que quanto maior é o grau de comprometimento do epitélio seminífero, observado em quatro categorias, menor é a concentração sérica de FSH, sendo, portanto não somente um indicador de espermatozóides na biópsia como também um indicador do grau de dano do epitélio seminífero.
Palavras chave: epitélio seminífero, espermatozóide, testículo, gonadotrofinas hipofisárias.
ABSTRACT
The objective of this study was to assess the concentration of pituitary gonadotropins, testicular histology and the detection of motile or non-motile spermatozoa in the testicular biopsy of azoospermic patients in order to establish a correlation between these variables.This was a cross-sectional retrospective study, which assessed the histological integrity of 27 azoospermic patients, who were divided into two groups: those with a obstructive origin (n=11; 40.7%) and those with non-obstructive origin (n=16; 59.3%). The analysis classified the histological findings in 4 categories according to the maximal cellular development achieved: total epithelial hyalinization; presence of Sertoli cells only; presence of primary spermatocytes; presence of elongated spermatids. Samples were classified in three groups based on sperm detection: presence of motile spermatozoa, presence of non-motile spermatozoa and absence of spermatozoa. Only 40% of patients undergoing testicular biopsy presented elongated spermatids and/or spermatozoa, and among patients with non-obstructive azoospermia, 12.5% presented elongated spermatids versus 82% of patients with obstructive azoospermia. As well, the detection of spermatozoa in the biopsy was also correlated with the FHS level. Mean LH levels showed a trend towards a behavior similar to FSH. This work reaffirms the importance of the plasma level of pituitary gonadotropins in the detection of spermatozoa in testicular biopsies in azoospermic patients. It also reveals that the higher the degree of involvement of the seminiferous epithelium, observed in four categories, the lower is the serum FSH level. Therefore, it is not only a marker for spermatozoa in biopsy, but a marker of the degree of damage to the seminiferous epithelium as well.
Key words: seminiferous epithelium, spermatozoa, testis, gonadotropins.
INTRODUÇÃO
A espermatogênese pode ser interrompida em qualquer estádio do ciclo do epitélio seminífero, levando a um quadro azoospermia e conseqüente infertilidade. A injeção intracitoplasmática de espermatozóide é uma técnica estabelecida para casos de número muito pequeno ou mesmo ausência de espermatozóide. Nesse último caso se utiliza a extração de espermatozóides do testículo e, quando encontrado, é realizada a microinjeção em um óvulo ainda não fertilizado (Palermo et al., 1992). A extração de espermatozóides do testículo inclui mecanismos de isolamento enzimático dos espermatozóides testiculares (Salzbrunn et al., 1996).
A concentração de gonadotrofinas hipofisárias como o hormônio folículo estimulante (FSH) e o hormônio luteinizante (LH), bem como de testosterona e prolactina, têm sido referidos na literatura científica com bastante controvérsia com relação à correlação dos valores séricos com o quadro histológico de pacientes azoospérmicos. Segundo Mattheus et al. (1981) a elevação da concentração de gonadotrofinas foi encontrada apenas em pacientes com defeitos graves de densidade espermática, e não foram correlacionados com motilidade ou morfologia espermática alterada. No trabalho de Souza et al. (2003) a concentração de FSH abaixo de 17 IU/L foi considerada indicadora de recuperação espermática no testículo de pacientes azoospérmicos. Já, Aydos et al. (2003) avaliaram 108 pacientes com as mais diversas patologias no epitélio seminífero e não encontraram correlação com as concentrações de FSH e LH, como também observou Hauser et al. (2002).
Considerando que a integridade do epitélio seminífero está comprometida em pacientes azoospérmicos sem vasectomia, este estudo compõe objetivos que buscam identificar o arranjo celular existente em pacientes com azoospermia por vasectomia e não obstrutiva comparando com as concentrações hormonais e a presença de espermatozóides ou espermátides alongadas, móveis ou imóveis no material biopsiado.
MATERIAL E MÉTODOS
Este foi um estudo transversal retrospectivo que analisou através de cortes em parafina, a integridade do epitélio seminífero de pacientes azoospérmicos vasectomizados e não vasectomizados.
PACIENTES
Os pacientes foram provenientes do ambulatório de reprodução humana do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, da Universidade Federal do Rio grande do Sul. Estes foram divididos em dois grupos, os com azoospermia de origem obstrutiva (vasectomizados, n=11; 40,7%) e os de origem não obstrutiva (não vasectomizados, com características histológicas compatíveis com não obstrução e histórico de infertilidade, n=16; 59,3%). As biópsias foram realizadas com o objetivo de se extrair espermatozóides para congelação e posterior fertilização in vitro. A classificação dos pacientes não vasectomizados em azoospérmicos não obstrutivos foi realizada através da análise da histologia testicular, onde foi detectado um epitélio incompatível com espermatogênese normal.
A idade média dos pacientes foi de 34 anos, onde a idade mínima foi de 24 e a máxima de 45.
MÉTODOS
As amostras de testículo foram obtidas de pacientes com diagnóstico de azoospermia segundo Organização Mundial da Saúde-OMS (World Health Organization, 1999). Os blocos de parafina com as amostras estavam armazenados no setor de patologia do já referido hospital, as quais foram escolhidas amostras do período de 2000 a 2003. Os pacientes foram submetidos à biópsia testicular sob anestesia local com lidocaína 0,5%. Uma pequena incisão longitudinal no escroto foi realizada com exposição da túnica albugínea e visualização dos vasos subtúnicos. Com secção tecidual e compressão testicular foi realizada a extração de tecido testicular. As amostras foram então fracionadas em duas partes, sendo uma fixada em solução de Bouin e enviado para análise histológica no setor de patologia do mesmo hospital e a restante colocada em uma placa de Petri e enviada imediatamente para o laboratório de biologia da reprodução, para a recuperação de espermatozóides para uma posterior injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI).
No laboratório de biologia da reprodução, as amostras foram processadas de forma similar àquela descrita por Salzbrunn et al. (1996), e foram classificadas, após a centrifugação, antes da adição do crioprotetor, quanto ao achado de espermatozóides em três grupos: presença de espermatozóides móveis, presença de espermatozóides imóveis e ausência de espermatozóides, respectivamente 1, 2 e 3.
ANÁLISES HISTOLÓGICAS
As amostras de testículo foram fixadas em Bouin e processadas no histotécnico, incluídas em parafina e cortadas no micrótomo em seções de aproximadamente 7mm de espessura. Os cortes foram desparafinados em álcool decrescente, hidratados e corados com hematoxilina e eosina.
A análise classificou os achados histológicos em 4 categorias conforme o máximo desenvolvimento celular atingido: grupo 1- hialinização total do epitélio; grupo 2- Presença apenas de células de Sertoli; grupo 3- Presença de espermatócitos primários; grupo 4- Presença de espermátides alongadas.
ANÁLISES HORMONAIS
Os pacientes foram submetidos a dosagens hormonais de FSH, LH, prolactina e testosterona total, na primeira de consulta. As amostras foram centrifugadas a velocidade de 2500 rpm para separação do plasma e congeladas a -20 ºC para posterior análise. As dosagens de FSH, LH e prolactina foram analisadas utilizando quimioluminescência com kits comerciais (Immulite Ltda®, USA) e as dosagens de testosterona total utilizando radioimunoensaio com o kit comercial (INC®, Germany). As variações inter e intrakits foram 5,45 e 13,3% para prolactina, 2,8 e 4,2% para FSH, 2,6 e 3,8% para LH e 3,3 e 4,9% para testosterona total. Os kits não demonstraram reação cruzada significante entre os hormônios avaliados.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise das concentrações de testosterona e prolactina, por se tratarem de variáveis contínuas, foi realizada por análise de variância. Para análise das variações de FSH e LH foi realizado o teste do Qui-quadrado.
RESULTADOS
As freqüências dos achados histológicos nas biópsias testiculares de todos os pacientes avaliados, estão na Tabela I.
Tabela I. Classificação dos 27 pacientes azoospérmicos quanto às células do epitélio seminífero.
A Figura 1 compara o tipo de azoospermia (obstrutiva e não obstrutiva) nos diferentes grupos de classificação quanto aos achados histológicos.
Figura I. Freqüência dos achados histológicos nos grupos de pacientes com azoospermia de origem obstrutiva e não obstrutiva. P<0,04.
Quanto à freqüência de espermatozóides, a amostra foi analisada no laboratório para observação de células espermáticas a fresco, ou seja, no momento da biópsia: 6 (22,2%) indivíduos apresentaram espermatozóides móveis; 10 (37,0%) indivíduos apresentaram espermatozóides imóveis e 11 (40,7%) indivíduos não apresentaram espermatozóides na amostra. A Tabela II apresenta os resultados destes percentuais para cada grupo de pacientes.
Tabela II. Freqüência do achado de espermatozóides nas biópsias a fresco, nos dois grupos de pacientes azoospérmicos.
As dosagens de prolactina e testosterona não foram diferentes nos grupos classificados quanto ao tipo máximo de desenvolvimento celular (Tabela III) e presença ou não de espermátides alongadas e/ou espermatozóides móveis ou imóveis na amostra (Tabela IV).
Tabela III. Variações das concentrações de testosterona e prolactina nos pacientes classificados quanto ao máximo desenvolvimento celular alcançado.
Tabela IV. Concentração média de testosterona e prolactina nos pacientes em que foi encontrado ou não espermatozóides na amostra retirada no momento da biópsia testicular.
As concentrações de FSH e LH foram significativamente diferentes entre os grupos classificados segundo o máximo desenvolvimento celular (Tabela V).
Tabela V. Concentração média de FSH e LH nas diferentes classificações histológicas.
Na Tabela VI estão demonstradas os resultados das concentrações médias de FSH e LH nos diferentes grupos segundo a presença ou não de espermatozóides na amostra retirada no momento da biópsia. Também houve uma diferença significativa nestes grupos com relação à concentração de FSH.
Tabela VI. Concentração média de FSH e LH nos pacientes em que foi encontrado ou não espermatozóides na amostra retirada no momento da biópsia testicular.
DISCUSSÃO
As análises histológicas realizadas no epitélio germinativo de pacientes azoospérmicos serviram para observar que apenas 40% dos pacientes submetidos à biópsia testicular apresentaram espermátides alongadas e/ou espermatozóides, e que daqueles pacientes azoospérmicos e sem vasectomia, 12,5% apresentaram espermátides alongadas contra 82% dos pacientes com azoospermia por vasectomia. Os resultados da Tabela I são dados gerais de todos os pacientes e foi observado que 60% deles não apresentavam espermatócitos primários, ou seja, não chegavam a realizar meiose. Para ilustrar a importância deste processo na formação de espermátides alongadas, Yogev et al. (2000) avaliaram por hibridização “in situ” o pareamento do par sexual e do par autossômico 18 em 14.422 espermatócitos de pacientes com azoospermia. A formação bivalente foi negativamente associada com espermátide madura, e a proximidade do par sexual em pacientes sem espermátides alongadas foi de apenas 20%.
A Tabela II apresentou os resultados obtidos da análise a fresco da amostra biopsiada. Neste momento foi feita à pesquisa de espermátides alongadas ou espermatozóides para congelação para uma futura ICSI. Foi observado que todos os pacientes com azoospermia por vasectomia apresentaram espermátides alongadas e/ou espermatozóides, porém 45,5% destas células eram imóveis. Este resultado não confere ao observado na histologia, onde 20% dos pacientes com azoospermia por vasectomia não apresentavam espermatozóides e/ou espermátides alongadas. Na análise a fresco da amostra, os pacientes com azoospermia e sem vasectomia, 70% não apresentaram espermátides alongadas e/ou espermatozóides e 30% deles sim, porém estas células se apresentavam imóveis. Novamente este dado está diferente do achado histológico, onde foi encontrado apenas 12,5% destes pacientes (azoospermia não obstrutiva) apresentando espermátides e/ou espermatozóides. A explicação para estas diferenças está em que, em algumas ocasiões, espermátides podem ser liberadas na luz do túbulo seminífero antes de alcançar a maturidade, devido à disfunção do epitélio seminífero. Mesmo as espermátides alongadas que detém uma relação normal com as células de Sertoli podem ser liberadas pela ruptura mecânica dos túbulos seminíferos no momento que se prepara o material biopsiado para congelamento. Além disto, o flagelo da espermátide pode se mover, e é praticamente impossível distinguir entre um espermatozóide recém liberado na luz do túbulo das espermátides prontas ou imaturas (Tesarik, 1997). Também existe a possibilidade de se encontrar a classificação denominada “mixed atrophy” que indica pontos de desenvolvimento celular avançado no epitélio seminífero, misturados a quadros patológicos graves como o da síndrome de células de Sertoli (Jesek et al. 1999). No entanto, estes poucos pontos de desenvolvimento não são suficientes para que sejam observados espermatozóides no sêmen, pois segundo Silber et al (1997), são necessários no mínimo 4-6 espermátides maduras por túbulo para que algum espermatozóide atinja o ejaculado.
Apesar dos níveis elevados de FSH não serem relatados como um sinal patognomônico em pacientes azoospérmicos (Aydos et al. 2003), no presente estudo os quatro grupos de pacientes, classificados quanto à população celular na biópsia, foram significativamente diferentes como mostram os resultados da Tabela V. A Tabela VI, da mesma maneira, apresenta resultados que mostram que o achado de espermatozóides na biópsia também foi correlacionado com a concentração de FHS, como também foi encontrado por Souza et al. (2003). Em ambos os casos, menores níveis de FSH foram encontrados em pacientes que apresentavam espermátides alongadas. Estes resultados estão de acordo com trabalhos como de Seo & Ko (2001) e Souza et al. (2003) que observaram que os níveis de FSH foram importantes em predizer o achado de espermatozóides na biópsia em pacientes azoospérmicos. No presente estudo os níveis médios de LH nas duas tabelas mostram a tendência de comportamento semelhante ao do FSH. A testosterona e a prolactina não apresentaram diferenças entre os pacientes dos diferentes grupos, provavelmente pelo perfil do ritmo circadiano excessivamente pulsátil (Razvi et al. 1999; Oehninger et al. 1997).
Este trabalho reitera a importância da concentração plasmática das gonadotrofinas hipofisárias no achado de espermatozóides na biópsia testicular em pacientes azoospérmicos. Também revela que quanto maior é o grau de comprometimento do epitélio seminífero, observado em quatro categorias, menor é a concentração sérica de FSH, sendo, portanto, não somente um indicador de espermatozóides na biópsia, como também um indicador do grau de dano do epitélio seminífero.
AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pela concessão da bolsa de pós-doutor. Ao GPPG, pelo apoio financeiro ao projeto, ao Dr. Tadeu Carlos Cersky, chefe do laboratório de Patologia Experimental do Centro de Pesquisas do Hospital de Clínicas de Porto Alegre pela permissão do uso das lâminas de histologia do Serviço e pelas valiosas opiniões.
Tesarik, J. Sperm or spermatid conception? Fertil. Steril., 68:214-216, 1997.